淡色库蚊arrestin基因克隆及其在抗药性中作用的初步研究

论文摘要

淡色库蚊（Culex pipiens pallens）是我国重要的家栖性传病媒介，严重危害人类健康。化学防制是控制蚊媒的有效手段。随着杀虫剂的长期大量使用，蚊媒对杀虫剂的抗性随之发生发展。鉴定新的抗药性基因并研究其如何参与抗药性机制，已成为媒介抗药性领域新的研究热点。本实验室前期研究发现并证明，视蛋白基因(opsin)为蚊抗药性相关基因。在进一步研究其抗性机制中发现，arrestin可能也参与蚊对溴氰菊酯抗性，另有文献报道，在致倦库蚊抗氯菊酯品系和果蝇抗DDT品系中，其arrestin较敏感品系高表达。在此基础上，本课题通过PCR方法，从淡色库蚊抗性品系中扩增arrestin基因的ORF序列，并采用RACE法扩增其5’和3’末端，对位拼接获取全长序列；通过实时荧光定量PCR分析arrestin在淡色库蚊敏感品系和抗性品系各发育阶段中的表达；随后，在蚊细胞水平先后通过转染高表达和RNAi低表达的方法，用CCK8方法检测arrestin对蚊细胞溴氰菊酯敏感性的影响，同时通过过荧光实时定量PCR检测蚊抗药性基因CYP6A1和opsin的表达水平。本研究获得了淡色库蚊arrestin基因的全长cDNA序列，编码384个氨基酸（GenBank ID: HQ833831,2011）。其推导的氨基酸序列与致倦库蚊、冈比亚按蚊、黑腹果蝇的arrestin同源性分别为99％、92％、71％。荧光定量PCR结果显示，arrestin基因在淡色库蚊抗性和敏感品系的不同发育阶段均有表达，其中在卵、蛹和成虫阶段，抗性品系中较敏感品系高表达（p<0.05）。蚊细胞高表达arrestin后，细胞对溴氰菊酯的敏感性降低，CYP6A1和opsin的表达增高；蚊细胞低表达arrestin（siRNA介导的arrestin基因沉默）后，细胞对溴氰菊酯的敏感性增加，CYP6A1和opsin的表达降低。以上结果表明，arrestin为一新的蚊抗药性基因， arrestin可能通过与视蛋白一起作用，改变与拟除虫菊酯抗性相关的细胞色素P450的表达，参与蚊对溴氰菊酯的抗性。本研究首次报告蚊arrestin为一新的抗药性基因，并初步探讨了arrestin参与抗药性的机制。本研究结果为进一步阐明抗药性的分子机制，建立抗药性的检测方法和治理抗药性提供了新的科学依据，具有重要的理论意义和潜在的实际应用价值。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料与方法
• 一、 材料
• （一） 供试蚊
• （二） 细胞株
• （三） 主要试剂
• （四） 主要仪器设备
• 二、 方法
• （一） 淡色库蚊 arrestin 基因全长克隆
• （二） 生物信息学分析
• （三） 实时荧光定量 PCR 分析 arrestin 在蚊抗性、敏感品系不同发育阶段的表达
• （四） 高表达 arrestin 对蚊细胞溴氰菊酯敏感性的影响
• （五） 抗性蚊细胞 arrestin 低表达对蚊溴氰菊酯敏感性的影响
• （六） 统计分析
• 结果
• 一、 淡色库蚊 arrestin 基因克隆
• （一） arrestin 基因 ORF 序列扩增
• （二） arrestin 基因 5′端序列和 3′端序列的扩增
• 二、 生物信息学分析
• （一） arrestin 基因及其编码氨基酸的序列分析
• （二） arrestin 基因编码氨基酸同源性和分子进化分析
• 三、 实时荧光定量 PCR 分析 arrestin 在蚊抗性、敏感品系不同发育阶段的表达
• 四、 高表达 arrestin 对蚊细胞溴氰菊酯敏感性的影响
• （一） 昆虫表达载体构建及重组质粒的抽提
• （二） 实时荧光定量 PCR 验证瞬转效率
• （三） Western blotting 鉴定 arrestin 的表达
• （四） 高表达 arrestin 对蚊细胞溴氰菊酯敏感性的影响
• （五） 实时定量 PCR 检测 CYP6A1 和 opsin 在各组细胞中的表达
• 五、 低表达 arrestin 对蚊细胞溴氰菊酯敏感性的影响
• （一） 蚊细胞 arrestin 片段的克隆
• （二） siRNA 干涉效率验证
• （三） 低表达 arrestin 对蚊细胞溴氰菊酯敏感性的影响
• （四） 实时定量 PCR 检测 CYP6A1 和 opsin 在各组细胞中的表达
• 讨论
• 一、 淡色库蚊 arrestin 全长基因克隆分析
• 二、 淡色库蚊 arrestin 与抗药性的关系及其机制探讨
• 三、 实验中的相关技术讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 攻读学位期间发表文章情况
• 附录
• 致谢