叶酸受体αDNA疫苗的构建及免疫活性的初步研究

论文摘要

目的:叶酸受体α（FRα）为一种分子量为38KD细胞膜糖蛋白,通过糖基磷脂酰肌醇锚定在细胞膜上。研究表明,FRα在正常组织中分布极少,而在卵巢肿瘤细胞表面有大量表达。因此,被认为是一种极具潜力的卵巢癌相关抗原。本研究利用FRα的肿瘤抗原特异性,构建FRα-pc DNA3.1 DNA疫苗,检测其诱导FRα特异性免疫反应能力,为开发卵巢癌治疗药物奠定基础。实验方法:本实验从高表达叶酸受体α的卵巢癌细胞株SKOV3中提取总RNA,通过逆转录得到含有FRα基因的c DNA,根据已报道FRα基因序列设计特异性引物PCR扩增FRα基因片段,并在起始密码ATG处加上Konzak序列。目的基因使用HindⅢ和Eco RⅠ双酶切后酶连到真核细胞表达载体pc DNA3.1中以获得新构建的重组质粒。将重组质粒通过脂质体介导法转染入人胚肾细胞HEK293中,从而获得含有目的基因的工程菌株。利用RT-PCR、Western blot及细胞免疫荧光染色检测细胞内FRα的表达。FRα作为核酸疫苗免疫BALB/c小鼠,通过ELISA实验、淋巴细胞增殖实验和细胞毒性杀伤实验研究该疫苗激发细胞免疫反应及体液免疫反应强度。结果:通过RT-PCR扩增得到750bp左右的FRα基因片段,并构建了真核表达重组质粒,经酶切、测序鉴定正确。转染HEK293细胞72h后,RT-PCR检测到细胞中FRαm RNA的存在,Western blot、细胞免疫荧光证明FRα蛋白在细胞中的表达。重组质粒免疫小鼠后,ELISA检测血清中抗FRα抗体滴度明显上升,小鼠脾淋巴细胞体外增殖明显,但FRα特异性CTL反应不明显。结论:本实验成功构建了FRα-pcDNA3.1 DNA疫苗,并建立了疫苗活性研究方法,实验结果显示该疫苗具有一定的抗肿瘤活性,为开发卵巢癌治疗药物奠定基础。

论文目录

• ABBREVIATION
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1 卵巢癌
• 2 叶酸受体 α
• 3 基于叶酸受体 α 的卵巢癌基因免疫治疗
• 4 CpG ODN佐剂
• 5 本文研究思路及技术路线图
• 第一章 FRα真核表达重组质粒的构建
• 1.1 实验材料和仪器
• 1.1.1 菌种与质粒
• 1.1.2 细胞株
• 1.1.3 试剂
• 1.1.4 培养基/缓冲液配制
• 1.1.5 仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 FRα cDNA的制备
• 1.2.2 FRα- pcDNA3.1 重组质粒的构建
• 1.2.4 重组质粒鉴定
• 1.2.5 重组质粒的大量制备以及测定
• 1.3 实验结果
• 1.3.1 FRα cDNA的制备
• 1.3.2 FRα-pcDNA3.1 重组质粒的构建
• 1.4 讨论
• 1.5 本章小结
• 第二章 FRα 在HEK293细胞中的瞬时表达以及鉴定
• 2.1 实验材料和仪器
• 2.1.1 细胞株
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 培养基/缓冲液配方
• 2.1.4 仪器
• 2.2 脂质体法瞬时转染HEK293细胞
• 2.2.1 HEK293细胞铺板
• 2.2.2 转染样品的准备
• 2.3 FRα 表达鉴定
• 2.3.1 Western blot鉴定
• 2.3.2 细胞免疫荧光鉴定
• 2.3.3 RT-PCR鉴定
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 Western blot鉴定
• 2.4.2 细胞免疫荧光
• 2.4.3 RT-PCR鉴定
• 2.5 讨论
• 2.6 本章小结
• 第三章 叶酸受体α核酸疫苗活性研究
• 3.1 实验材料及仪器
• 3.1.1 实验动物
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 培养基/缓冲液配方
• 3.1.4 仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 DNA疫苗免疫
• 3.2.2 小鼠血清抗体滴度检测
• 3.2.3 小鼠脾细胞增殖实验
• 3.2.4 CTL特异性杀伤实验
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 血清中抗体滴度检测
• 3.3.2 小鼠脾细胞增殖实验
• 3.3.3 CTL实验
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 本文总结
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 附录1 pMD-18T质粒图谱及 pc DNA3.1（+） 质粒图谱
• 附录2 FRα-pc DNA3.1测序结果
• 附录3 硕士阶段已发表文章
• 致谢