论文摘要
结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是最常见的消化道肿瘤之一,在全球各种肿瘤中发病率居第三位,死亡率居恶性肿瘤的第二位。大肠癌对化疗不敏感,即使在施行根治手术和辅助化疗后仍有较高的转移发生率。5-氟尿嘧啶（5- fluorouracil 5- FU）最早于1957年合成并投入临床使用,目前它仍然是胃肠道肿瘤化学治疗中的最主要药物之一。但是,只有低于25%的晚期结肠癌病人对5-FU的化疗具有明显的反应。有些结肠癌病人在化疗起始阶段对5-FU的化疗有效,但随着化疗的进行病人开始出现对5-FU的耐药现象。研究表明,凋亡是化疗药物（如：5-FU）发挥化疗药物毒性的最初的作用形式,并且抑制引起凋亡的信号途径发挥其作用是化疗药物发生耐药的机制之一。凋亡的发生可以通过两条经典的途经,首先是外源性诱导凋亡途径,由死亡受体诱导引起,如：Fas和FasL。其次是内源性诱导凋亡途径,即线粒体凋亡途径,它与细胞色素C,凋亡肽诱导因子（APAF-1）, caspas-9前体的相互作用后,激活caspas-9前体,进而诱导癌细胞发生凋亡。由此可知,5-FU作为重要的抗肿瘤药物,在结肠癌中诱发的体凋亡途径的作用和调节机制非常重要并值得继续深入研究和探索。研究表明microRNA已经越来越成为结肠癌的发生,发展,治疗和预测预后的重要指标和调节分子。然而,microRNA对结肠癌化疗反应后的凋亡机制的调节目前还没有清楚地研究机制。为了探索microRNA在结肠癌化疗反应后对细胞凋亡的调节机制,我们推测是否在化疗反应后与凋亡相关的miocRNA来调节凋亡的内源性凋亡通路来影响结肠癌对化疗药物的敏感性。通过查阅文献,选择经过高通量的miRNAs芯片技术对miRNAs的差异表达进行筛选后确定的,与5-FU对结肠癌化疗敏感性相关的miRNAs。同时,通过实时定量PCR的常规检测验证这些通过文献筛选的与化疗敏感性相关的microRNA。我们检测了4条miRNAs的成熟体（microRNA21,210,224,23a）在化疗药物5-FU（终浓度为IC50）处理后表达情况。最终筛选出miR-23a与5-FU化疗药物敏感性相关,并进行深入的研究。通过体外功能实验分析了miR-23a在细胞的增殖、凋亡和细胞毒性的功能。我们首先通过Cell Counting Kit-8试剂盒检测经过化疗药物5-FU处理的结肠癌细胞的增殖和毒性。发现miR-23a不能促进结肠癌细胞HCT116增殖,在结肠癌细胞HT29中miR-23a虽能增加细胞增殖水平,但过表达miR-23a抑制剂在HCT116和HT29中均不能抑制细胞的增殖。这一结果说明,miR-23a对结肠癌细胞的增殖功能影响不明确,但不能否定它对细胞的增殖具有一定的影响。进一步通过细胞毒性实验检测miR-23a对经过化疗药物5-FU处理后细胞毒性的检测。发现miR-23a模拟剂明显减低5-FU的毒性,增加细胞的存活率。而miR-23a抑制剂能增加5-FU的毒性从而增加结肠癌细胞的死亡数。通过细胞毒性试验我们确定miR-23a能够明显调节经过化疗药物处理的结肠癌细胞的生存能力。为了深入研究miR-23a的生物功能我们通过AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒进行了凋亡检测,发现过表达miR-23a抑制剂同时用5-FU处理细胞比单独应用5-FU化疗结肠癌细胞明显增加结肠癌细胞的凋亡水平。通过上面的实验我们发现microRNA-23a通过影响化疗后结肠癌细胞的凋亡水平来发挥其功能,同时影响化疗药物5-FU处理的结肠癌细胞的增殖和细胞毒性。通过microRNA-23a影响化疗药物5-FU化疗敏感性相关的生物功能,我们进一步寻找与microRNA-23a通过调控哪些基因来发挥生物功能。首先我们根据microRNA靶基因预测网站对miR-23a的靶基因进行了分析。通过实时定量PCR初步筛选了几个与凋亡,细胞周期调控相关的靶基因。过表达microRNA-23a模拟剂和抑制剂后检测靶基因mRNA的表达改变情况,结果表明,发现只有靶基因APAF-1的mRNA表达水平明显与microRNA-23a的表达成负相关。我们又通过Western blot从蛋日表达水平和双灾尤系酶报告系统技术验证了miR-23a与5-FU化疗敏感性相关的靶基因为凋亡肽诱导因子—-APAF-1。为了进一步明确microRNA-23a在体内对化疗药物5-FU化疗敏感性的影响。我们进一步构建了稳定表达生物发光和1nicroRNA-23a抑制剂序列的结肠癌HCT116和HT29细胞株。通过建立移植瘤动物模型,尾静脉注射化疗药物5-FU来对小鼠进行化疗,来观测肿瘤的生长和生物发光的强度。结果表明瘤内稳定高表达miR-23a抑制剂可以明显的增强化疗药物5-FU的化疗敏感性,miR-23a抑制剂与5-FU联合化疗可以明显抑制肿瘤的生长（与单独接受5-FU化疗而不过表达miR-23 a抑制剂组相比）。通过小鼠活体成像系统检查裸鼠肿瘤的生物发光强度得到了与检测移植瘤体积一致的结果。体内实验结果表明瘤内稳定高表达1niR-23a抑制剂可以明显的增强化疗药物5-FU的化疗敏感性。通过体内和体外实验我们明确了microRNA-23a对化疗药物5-FU的化疗敏感性具有明显的抑制作用,同时microRNA-23a的靶基因为APAF-1,在凋亡通路的线粒体通路中发挥着重要的作用,因此进行了机制研究。本实验通过免疫荧光技术检测了经过化疗药物5-FU处理后的结肠癌细胞中Cyt-c自线粒体释放入胞浆过程。同时,我们用Western blot方法检测在结肠癌HCT116或HT29细胞中经过5-FU化疗处理后靶基因APAF-1的表达情况。结果表明：经过化疗药物5-FU处理结肠癌细胞后,诱导细胞色素C释放入胞浆,并引起miR-23a表达升高,靶基因APAF-1蛋白表达量降低。为了检测miR-23a对线粒体凋亡通路中caspase-9活性的影响,我们通过转染miR-23 a抑制剂后用5-FU处理细胞,通过Caspase-9分光光度法检测试剂盒检钡caspase-9活性。发现miocRNA23a抑制剂与化疗药物5-FU共同作用比单独应用化疗药物5-FU组相比明显上调caspase-9活性。为了进一步确定靶基因APAF-1在5-FU化疗引起的线粒体凋亡通路中的重要作用,故我们通过RNA干扰的方式,降低靶基因APAF-1的表达,同时过表达miR-23a抑制剂后用5-FU处理细胞,并检测aspase-9活性的改变。结果表明,在通过RNA干扰的方式,减少或去除靶基因APAF-1的表达后,能够逆转过表达miR-23a抑制剂而引起化疗药物5-FU诱导的caspase-9活性增加的现象。总之,结肠癌细胞在化疗药物的压力下通过增加microRNA-23a的表达量来降低因为化疗引起的癌细胞凋亡。这也是结肠癌细胞对化疗的一种自我保护机制。同时在化疗药物5-FU结合microRNA-23a抑制剂同时处理结肠癌细胞可以明显增加结肠癌细胞对5-FU的化疗敏感性,增加化疗诱导的凋亡水平。以microRNA-23a抑制剂作为治疗药物或治疗佐剂来增强化疗效果的方法为结肠癌的治疗提供了新的思路和治疗靶点。
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相关论文文献
- [1].microRNA-23a对染氟成骨肉瘤细胞外调节蛋白激酶通路的影响[J]. 环境与健康杂志 2020(03)
- [2].microRNA-23a调控斑马鱼颅神经嵴细胞迁移和分化[J]. 发育医学电子杂志 2017(01)
- [3].microRNA-23a对氟暴露大鼠成骨肉瘤细胞成骨活性的影响及靶基因验证[J]. 环境与健康杂志 2019(09)
- [4].microRNA-10a联合microRNA-23a在结直肠腺癌早期诊断中的价值[J]. 肿瘤学杂志 2019(08)