来源于橄榄绿链霉菌A1的木聚糖酶XYNB的分子改良

论文摘要

木聚糖酶可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖,内切β-1,4-木聚糖酶以内切方式水解木聚糖分子中的β-1,4糖苷键,是一类重要的半纤维素酶。木聚糖酶在造纸、饲料、食品等行业和能源科学上都有着广泛的应用前景。来源于橄榄绿链霉菌（Streptomyces olivaceoviridis）A1的木聚糖酶XYNB是一种性质优良的木聚糖酶,具有高比活性,抗胃蛋白酶和胰蛋白酶,已在饲料中作为添加剂应用。但该酶的热稳定性一般,在应用上存在不足。本研究从提高该酶的热稳定性入手,通过定点突变和DNA shuffling的方法对木聚糖酶XYNB进行定向改良,将突变酶在毕赤酵母中表达纯化并对其酶学性质进行分析,以确定突变效果。同时,对该酶的催化残基、影响最适pH的因素也做了一定的分析。通过定点突变的方法,获得了热稳定性有所提高的突变酶N13D、S40E、T11Y、XS和TB。其中,突变酶N13D和S40E在70℃处理5min,热稳定性分别比XYNB提高了24.76%和14.46%;T11Y突变酶在70℃处理10min,热稳定性是XYNB的2.8倍;增加二硫键的突变酶XS在70℃的半衰期由XYNB的3min提高到9min;氨基端替换获得的融合酶TB,热稳定性较XYNB有很大的提高,在70℃的半衰期由XYNB的3min提高到20min。再对以上突变位点进行优化组合,获得了突变酶TS（氨基端替换结合二硫键的加入）,最终比XYNB在70℃处理20min的热稳定性提高了12.4倍,半衰期由原来的3min提高到150min。突变酶TS由于具有很好的热稳定性和pH稳定性,在工业上有较好的应用前景。通过同源建模和定点突变,获得突变酶E87F、E177F和N46D。突变酶E87F、E177F的酶活性几乎完全丧失,推断E87、E177是木聚糖酶XYNB的催化残基。突变酶N46D的最适pH值由5.2下降到4.2,pH稳定性也向酸性pH偏移,同时,最适温度和热稳定性也有一定的提高,结果证实木聚糖酶XYNB的第46位的氨基酸与其最适pH值相关,并对酶的酸碱催化反应起重要的作用。通过DNA shuffling的方法构建木聚糖酶XYNB的突变体库,定向筛选热稳定性有所提高的突变酶,从700个表达菌株中筛选出sh-94#突变酶,将突变酶基因在毕赤酵母中表达,研究发现,sh-94#在70℃的热稳定性较野生型酶XYNB提高了1倍。又筛选到sh-17#突变酶,它的最适温度由原酶的60℃下降到40℃,热稳定性有所下降。初步建立了应用DNA shuffling的方法对木聚糖酶XYNB进行热稳定性的定向改良的研究体系,为今后木聚糖酶的进一步改良奠定了基础。本研究通过基因工程的手段,定向改良了木聚糖酶XYNB的热稳定性,推测出了木聚糖酶XYNB的催化残基并分析了在催化反应中起重要作用的氨基酸残基。研究中获得的一系列突变酶对研究木聚糖酶结构和功能的关系起到了重要的作用,对指导木聚糖酶的进一步改良提供了良好的研究材料。

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ABSTRACT

第一章引言

第一节木聚糖酶的结构与功能

1 木聚糖酶（Xylanase）的分类及结构区域

1.1 木聚糖酶的分类

1.2 木聚糖酶的结构区域

2 木聚糖酶的催化机制

3 木聚糖酶分子结构与重要酶学性质关系的研究进展

3.1 木聚糖酶的催化残基

3.2 木聚糖酶的热稳定性

3.2.1 热稳定区（TSD）

3.2.2 盐桥（Salt bridge）

3.2.3 二硫键（Disulfide bridge）

3.2.4 芳香族氨基酸

3.2.5 蛋白质表面精氨酸和脯氨酸的含量

3.2.6 一些保守的氨基酸

3.3 木聚糖酶的最适pH和pI

3.4 木聚糖酶的底物结合区

4 问题与展望

第二节 DNA改组（DNA shuffling）技术简介

1 DNA改组的原理

2 DNA改组技术的发展

3 DNA改组技术的成果

4 DNA改组的应用前景

本研究的目的和意义

第二章木聚糖酶XYNB热稳定性的分子改良

1 实验材料

1.1 菌种和质粒

1.2 工具酶

1.3 试剂

1.4 培养基

1.5 主要仪器

2 研究方法

2.1 木聚糖酶XYNB的同源建模

2.2 突变位点的确定

2.3 突变方法

2.3.1 Over lapping PCR程序

2.3.2 两步PCR程序

2.3.3 突变试剂盒程序

2.3.4 突变引物

2.4 重组表达载体的构建

2.4.1 pET22b（+）-xynB'表达载体（xynB'指任意突变酶基因）

2.4.2 pPIC9-xynB'表达载体

2.5 重组木聚糖酶的表达及纯化

2.5.1 在大肠杆菌中的诱导表达

2.5.2 在毕赤酵母中的表达

2.5.2.1 酵母感受态的制备

2.5.2.2 酵母细胞的转化

2.5.2.3 转化子的筛选

2.5.2.4 目的基因在毕赤酵母中的表达检测

2.5.2.5 发酵罐水平重组酵母的高细胞密度发酵

2.5.3 重组酶的Western Blot分析

2.5.3.1 SDS-PAGE

2.5.3.2 Western Blot

2.5.4 重组木聚糖酶的纯化

2.6 木聚糖酶活性的测定

2.6.1 酶活单位定义

2.6.2 木糖（Xylose）标准曲线的绘制

2.6.3 木聚糖酶活性测定的方法

2.7 酶学性质的分析与比较

2.7.1 木聚糖酶最适pH和pH稳定性的测定

2.7.2 木聚糖酶最适反应温度和热稳定性的测定

2.7.3 金属离子和相关化学试剂对木聚糖酶活性的影响

2.7.4 木聚糖酶反应初速度的测定

2.7.5 木聚糖酶km和Vmax值的测定

2.7.6 木聚糖酶比活性的测定

2.7.6.1 标准曲线的绘制

2.7.6.2 比活性测定

2.7.7 纤维素酶活性的测定

2.7.8 木聚糖酶抗胃蛋白酶及胰蛋白酶的能力

3 结果

3.1 T11Y定点突变

3.1.1 同源建模及突变位点的确定

3.1.2 定点突变

3.1.3 重组表达质粒的构建

3.1.4 重组木聚糖酶T11Y的表达纯化

3.1.4.1 T11Y在大肠杆菌中的表达

3.1.4.2 T11Y在毕赤酵母中的表达

3.1.4.3 木聚糖酶T11Y的纯化

3.1.5 T11Y酶学性质的分析与比较

3.2 N13D、S40E定点突变

3.2.1 同源建模及突变位点的确定

3.2.2 定点突变

3.2.3 重组表达质粒的构建

3.2.4 重组木聚糖酶N13D、S40E的表达纯化

3.2.5 N13D、S40E酶学性质的分析与比较

3.3 木聚糖酶XYNB氨基端的替换

3.3.1 同源建模及突变位点的确定

3.3.2 木聚糖酶融合基因tb的构建

3.3.3 重组表达质粒的构建

3.3.4 重组木聚糖酶TB的表达纯化

3.3.4.1 TB在大肠杆菌中的表达

3.3.4.2 TB在毕赤酵母中的表达

3.3.5 木聚糖酶TB的纯化

3.3.6 TB酶学性质的分析与比较

3.4 XYNB及TB的二硫键突变

3.4.1 同源建模及突变位点的确定

3.4.2 突变位点的引入

3.4.3 重组表达质粒的构建

3.4.4 重组木聚糖酶XS和TS的表达纯化及二硫键的分析

3.4.4.1 重组木聚糖酶XS和TS的表达纯化

3.4.4.2 二硫键的分析

3.4.5 XS和TS酶学性质的分析与比较

4 讨论

4.1 T11Y定点突变

4.2 N13D、S40E定点突变

4.3 木聚糖酶XYNB氨基端的替换

4.4 XYNB及TB的二硫键突变

5 小结

第三章木聚糖酶XYNB催化残基的研究及最适pH值的分子改良

1 实验材料

2 研究方法

2.1 突变位点的确定

2.2 定点突变方法

2.2.1 E87F和E177F定点突变

2.2.2 N46D定点突变

2.3 重组表达载体的构建

2.4 重组木聚糖酶的表达及纯化

2.5 酶学性质的分析与比较

3 结果

3.1 突变位点的确定

3.2 定点突变

3.3 重组表达质粒的构建

3.4 重组木聚糖酶的表达及纯化

3.4.1 在大肠杆菌中的表达

3.4.2 在毕赤酵母中的表达

3.4.3 木聚糖酶N46D的纯化

3.5 酶学性质的分析与比较

4 讨论

第四章木聚糖酶XYNB的定向改良——DNA shuffling方法

1 实验材料

1.1 菌种和质粒

1.2 工具酶、试剂、培养基及主要仪器

2 研究方法

2.1 实验设计

2.2 目的基因片段的扩增

2.3 DNase I的酶切

2.4 酶切小片段的回收

2.5 无引物PCR

2.6 有引物PCR

2.7 构建突变体库

2.7.1 双酶切

2.7.2 连接

2.7.3 大肠杆菌感受态细胞的制备

2.7.4 大肠杆菌的转化

2.7.5 连接效率的鉴定

2.8 突变体重组子在木聚糖平板上的活性筛选

2.8.1 有木聚糖酶活性的菌落的筛选

2.8.2 热稳定性突变酶的筛选

2.9 突变酶基因在毕赤酵母中的表达纯化和酶学性质研究

3.结果

3.1 目的基因片段的扩增

3.2 DNase I的酶切

3.3 酶切小片段的回收

3.4 无引物PCR

3.5 有引物PCR

3.6 构建突变体库

3.7 突变体重组子在木聚糖平板上的活性筛选

3.7.1 有木聚糖酶活性的菌落的筛选

3.7.2 热稳定性突变酶的筛选

3.8 突变酶基因在毕赤酵母中的表达纯化

3.9 酶学性质研究

4 讨论

第五章结论

参考文献

致谢

作者简历

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