肝细胞转运蛋白的表达及ABCB4基因突变在婴儿胆汁淤积性肝炎发病机制中的探讨

论文摘要

第一部分肝细胞转运蛋白和法尼醇受体在婴儿胆汁淤积性肝炎肝组织中的表达及其意义目的研究MDR3、BSEP、MRP2和FXR蛋白在婴儿胆汁淤积性肝炎肝组织中的表达及其临床意义。方法2000年1月至2009年10月收治的婴儿胆汁淤积性肝炎患儿22例为病例组,收集临床资料,进行肝组织活检;肝移植供体10例,为正常对照组。采用免疫组化法检测MDR3、BSEP、MRP2和FXR蛋白在正常对照组及病例组肝组织中的表达。应用Leica Qwin软件进行定量分析。并对各蛋白的表达水平与肝功能指标的关系进行统计。结果正常对照组和病例组肝组织MDR3、BSEP和MRP2蛋白表达位于肝细胞膜,FXR蛋白表达位于肝细胞核。与正常对照组比较,病例组肝组织MDR3蛋白表达增强,MRP2和FXR蛋白表达降低,BSEP蛋白表达无改变。正常对照组和病例组肝组织MDR3蛋白A值分别为0.11±0.03和0.13±0.02,病例组MDR3蛋白A值显著增高（ t = - 2.239 , P <0.05）;BSEP蛋白A值分别为0.07±0.01和0.08±0.02,两组比较无差异（t = -1.625, P> 0.05）;MRP2蛋白A值分别为0.17±0.04和0.11±0.05,病例组MRP2蛋白A值显著降低（t= 3.418, P <0.05）;FXR蛋白A值分别为0.15±0.06和0.09±0.02,病例组FXR蛋白A值显著降低（t= 7.676, P<0. 001）。MRP2蛋白A值与血清ALT水平呈负相关（r=-0.488,P<0.05）,与血清TB、DB、γ-GT水平无相关（P >0.05）;MDR3和FXR蛋白A值与血清TB、DB、γ-GT、ALT水平均无相关性（P >0.05）。结论与正常肝组织相比,婴儿胆汁淤积性肝炎患儿肝组织中MRP2和FXR蛋白表达下降,MDR3蛋白表达增强,BSEP无变化。MDR3表达增强有利于增强磷脂的转运,与过高的胆盐结合,减轻肝损害,有可能是机体的适应反应。MRP2蛋白表达下降可因减少胆汁流而加重胆汁淤积。MRP2蛋白表达水平越低,血清ALT越高,肝损害越严重。MRP2蛋白表达的下调可能与FXR蛋白表达抑制相关。肝细胞转运蛋白表达的变化可能在婴儿胆汁淤积性肝炎的胆汁淤积的发病起到了一定的作用。第二部分UDCA对婴儿胆汁淤积性肝炎ABCB4和FXR mRNA表达的影响目的分析UDCA治疗前后婴儿胆汁淤积性肝炎ABCB4和FXRmRNA的差异性表达,探讨ABCB4和FXRmRNA表达变化对婴儿胆汁淤积性肝炎的影响以及与UDCA的关系。方法选择2008年7月至2010年7月确诊为婴儿胆汁淤积性肝炎患儿58例,随机分为2组,UDCA治疗组28例,常规治疗组30例;正常对照组30例。提取外周血总RNA,逆转录为cDNA。应用SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR的方法检测ABCB4、FXRmRNA在婴儿胆汁淤积性肝炎患儿和正常健康儿的表达。采用2-△△CT法进行相对定量分析。结果婴儿胆汁淤积性肝炎患儿应用UDCA治疗后TB、DB、ALT和γ-GT显著降低（P<0.05）。与常规治疗组比较,UDCA治疗组TB、DB下降值显著增高（P<0.05）,ALT和γ-GT的下降值无差别（P>0.05）。与正常对照组比较,婴儿胆汁淤积性肝炎患儿ABCB4mRNA的表达水平增高了4.53倍,FXR mRNA的表达无差异（P>0.05）。与UDCA治疗前比较,UDCA治疗后婴儿胆汁淤积性肝炎患儿ABCB4 mRNA表达水平增加了2.04倍,FXR mRNA的表达水平无显著差异（P>0.05）。ABCB4 mRNA的表达量与血清TB、DB、ALT和γ-GT水平无相关性（P>0.05）。结论UDCA有较好的利胆作用,可以改善婴儿胆汁淤积性肝炎的症状及实验室指标。UDCA可以上调ABCB4 mRNA的表达。与正常健康婴儿比较,婴儿胆汁淤积性肝炎ABCB4mRNA的相对表达量增高,为机体适应性代偿反应;FXRmRNA的相对表达量不变,未能证实FXR对ABCB4基因的转录调节作用。第三部分婴儿胆汁淤积性肝炎ABCB4基因突变的分析目的研究婴儿胆汁淤积性肝炎是否存在ABCB4基因突变,探讨分析ABCB4基因突变与婴儿胆汁淤积性肝炎的易感性和临床特征的关系。方法病例组婴儿胆汁淤积性肝炎100例,正常对照组149例,提取外周血基因组DNA,对病例组的ABCB4基因全部28个外显子以及侧翼内含子进行聚合酶链反应和直接测序,正常对照组针对病例组检出有突变的外显子进行检测,分析各突变位点的基因型和等位基因频率在病例组和对照组中的分布及基因型与肝功能各指标的关系。结果共发现ABCB4基因5个外显子突变,均为SNP位点,其中rs2109505不符合Hardy-weinberg平衡,rs2302387、rs1202283、rs8187791、rs2230028符合Hardy-weinberg平衡。本研究健康人群rs2302387位点以G/G基因型最常见;rs1202283位点以G/A基因型最常见;rs8187791位点以C/C基因型为主,T等位基因罕见;rs2230028位点以A/A基因型最常见,无G/G基因型。本研究健康人群rs8187791位点的基因型及等位基因频率的分布与各地区人群无明显差别,rs2302387、rs1202283和rs2230028位点的基因型及等位基因频率的分布与我国北京汉族及日本人群相近,部分与欧洲人群有差异,与非洲人群呈显著性差异（P<0.05）。rs2302387、rs1202283、rs8187791和rs2230028的基因型及等位基因频率在病例组和正常对照组的分布无显著性差异（P>0.05）。病例组rs2302387、rs1202283、rs8187791和rs2230028位点各基因型的肝功能指标比较无显著差异（P>0.05）。各单倍型在病例组和对照组的分布频率无差异（P>0.05）。结论ABCB4基因突变与婴儿胆汁淤积性肝炎易感性无关。首次报道ABCB4基因rs2302387、rs1202283、rs8187791、rs2230028位点在广西南宁地区人群中的分布情况。其中rs8187791位点基因型及等位基因频率的分布无明显地域差别。rs2302387、rs1202283、rs2230028三个位点多态性频率分布与北京及日本亚洲人群分布较一致,与欧洲及非洲人群分布有差异。

论文目录

• 一、中英文缩略词对照表
• 二、中文摘要
• 三、英文摘要
• 四、论文
• 前言
• 第一部分 肝细胞转运蛋白和法尼醇受体在婴儿胆汁淤积性肝炎肝组织中的表达及其意义
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 UDCA 对婴儿胆汁淤积性肝炎ABCB4 及FXR mRNA 表达的影响材料与方法
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第三部分 ABCB4 基因突变在婴儿胆汁淤积性肝炎的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 五、综述 ABCB4 基因与胆汁淤积性肝病的研究进展
• 参考文献
• 六、致谢
• 七、攻读博士学位期间科研活动情况