导读:本文包含了甲基化特异的法论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:白血病,DNA甲基化,肿瘤抑制基因,死亡相关蛋白激酶
甲基化特异的法论文文献综述
王浩,杨瑛,梁华[1]（2019）在《p73和DAPK基因启动子区CpG岛在不同类型白血病细胞基因组中存在特异甲基化位点的临床研究》一文中研究指出目的探讨死亡相关蛋白激酶(DAPK)与肿瘤抑制基因p73基因启动子区Cp G岛在不同类型白血病细胞基因组中存在特异甲基化位点的情况。方法通过亚硫酸氢盐测序法,研究DAPK与p73基因启动子区Cp G岛在单核细胞系白血病细胞株U937、淋巴细胞系Jurkat、粒细胞系HL-60和正常人白细胞基因组中的甲基化状态,收集测序结果,并对不同Cp G位点甲基化率进行计算;对上述4种细胞来源基因组中的DAPK与p73基因Cp G岛甲基化模式图进行绘制,并对其特异甲基化位点组合进行筛选。在40例正常对照、82例白血病患者外周血标本和白血病细胞株中,采用甲基化特异性PCR法对基因异常甲基化模式的诊断价值进行验证。结果测序含有亚硫酸氢盐测序法产物转化质粒的菌株共106个,且成功绘制DAPK与p73基因Cp G岛甲基化模式图。白血病细胞株DAPK与p73基因去甲基化程度较正常细胞基因组明显升高。在白血病粒细胞系HL-60中,DAPK基因与其它白血病细胞株甲基化状态明显不同。在白血病细胞株和正常细胞中,p73基因甲基化状态完全相反。DAPK基因甲基化检测可有效鉴别粒细胞系与淋巴细胞系白血病,其对急性非淋巴细胞白血病临床诊断的敏感度为68. 57%(24/35),特异度为100. 00%(27/27),准确性为82. 26%(51/62); p73基因甲基化检测可有效鉴别白血病细胞与正常细胞,其对白血病的临床诊断敏感度为29. 03%(18/62),特异度为100. 00%(40/40),准确性为56. 86%(58/102)。结论在不同临床分型的白血病细胞基因组中,DAPK与p73基因启动子区Cp G岛具有特异性的甲基化位点,可用于初步评估白血病不同分型,因此可作为临床重要的潜在肿瘤标志物,能够为后期探究白血病肿瘤甲基化标志物提供可行的检测方法和良好的实验基础。(本文来源于《临床和实验医学杂志》期刊2019年19期）
朱良亮[2]（2018）在《全基因组DNA甲基化分析探索LST在常见信号通路中的特异性表观遗传变异》一文中研究指出研究目的:1、探索结直肠侧向发育型肿瘤(laterally spreading tumor,LST)的DNA甲基化特征,尤其是对通常容易被忽略的基因组区域进行分析。2、探索LST和隆起型腺瘤(protruded-type adenoma,PA)之间主要的DNA甲基化差异。3、通过全基因组DNA甲基化分析来探讨LST在常见信号通路中的特异性表观遗传变异。研究方法:1、选取入组患者和采集样本2、甲基化450k芯片检测3、差异性甲基化位点(differentially methylated position,DMP)和差异性甲基化区域(differentially methylated region,DMR)的筛选使用配对t检验比较LST组与对照组β值的差异。应用Bonferroni校正后的q值<0.05,从每组配对比较中筛选LST相关的DMP。利用minfi软件包对DMP的潜在区域聚类进一步分析,确定所组成DMR。4、DMP的分布分析按所处的基因组区域、染色体位置对DMP进行分层,并在450k芯片中与各自分层相关的区域、位置进行比较。因样本量较小,我们使用Fisher’s独立精确检验来分析特定的基因组区域、染色体位置的DMP数量与预期值的差异是否存在统计学意义。然后再对超甲基化DMP与低甲基化DMP的数量比进行Fisher’s精确检验,以评估其是否在每个基因组区域、染色体位置中的分布差异都存在统计学意义。统计学检验水准设定为经Bonferroni校正的α=0.05。5、焦磷酸测序验证本实验在10组含正常黏膜对照的病例样本中进行研究,另外新增加了9组相同入组标准的病例样本以进行芯片检测结果验证。验证方法为焦磷酸测序。6、基因本体(Gene Ontology,GO)和通路富集分析7、组蛋白修饰富集分析8、公共数据的下载及标准化从NCBI基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)下载经过处理的DNA甲基化数据GSE48684。另从GEO下载了一套11对LST和匹配的正常结直肠粘膜的DNA甲基化数据和表达分析数据GSE77635。使用RNA-seq TMM方法标准化处理,来量化转录因子和与IGR DMP和DMR相关的最近基因的表达水平。9、使用18态ChromHMM模型计算DMP和DMR的观察值和预期值18态的ChromHMM模型从依据hg19标准人类基因组数据的Roadmap表观基因组计划数据库中下载。使用自定义R代码来计算表观基因组n中状态m的DMP和DMR预期总数,然后将研究中观察到的表观基因组n中状态m的DMP和DMR总数,与预期总数进行比较(具体公式详见正文部分)。10、识别转录因子结合位点(transcription factor binding site,TFBS)的富集从hg19人类基因组数据集中获得了抑制区DMP的基因组序列,并将DMP、DMR和450k探针的检测区间扩展到1000bp。利用MEME套件中的FIMO工具,使用默认脊椎动物数据库进行富集的结合模体查找分析,设定其检验水准q值(经FDR校正的p值)为0.05,当目标序列与背景序列的比值>1.1,定义为转录因子结合模体的显着富集。11、辅助数据的可用性本研究相关数据已保存在NCBI的基因表达综合数据库中,登记号为GSE106556。研究结果:1、在LST中发现DMP与DMR并验证我们首先明确了LST的DNA甲基化异常特点。经严格分析并采用必要的统计学校正方法(Bonferroni校正P<0.05,图3A)计算分析,确定了10个LST样本中2452个DMP。同时多个染色体的DMP分布差异也具有显着的统计学意义,特别是chrX(P<3.37×10~(-18),Fisher’s精确检验)和chr 8(P<1.85×10~(-16),Fisher’s精确检验)。值得注意的是,我们发现了1925个低甲基化的DMP(78.51%)显着高于527个超甲基化的DMP(21.49%)(图3B)。然后,利用minfi软件包分析确定了DMR,明确了73个超甲基化DMR和13个低甲基化DMR。随后我们使用焦磷酸测序方法,在研究组及另外9组新病例样本中,验证了位于不同基因组区域的4个位点(P值较小,差异性较大的位点)的甲基化水平(图4),结果发现所有4个位点在各样本中均显示出与450k芯片一致的差异性甲基化状态。2、DMP在IGR和TSS高度富集3、LST在TSS周围表现出显着的DNA甲基化异常4、IGR是LST的DNA甲基化水平异常的热区5、IGR的潜在功能研究发现“消化系统发育”是低甲基化的IGR-DMP调控的重要生物学功能,其中包括许多重要的发育转录因子,如TGFB2,FOXF1,FOXF2,GATA4,FGF10和FGF9(图8A)。研究同时发现,低甲基化的IGR-DMP与参与组蛋白去乙酰化的基因(HDAC2,HDAC4,HDAC9,NACC2,SALL1和SUDS3)(图8A)相关(组蛋白去乙酰化,-log10(P-值)=4.97)。该结果表明LST发生过程中DNA甲基化和组蛋白修饰之间存在相互作用的可能性。6、组蛋白H3K9me3在IGR-DMP高度富集7、正常粘膜的抑制区在LST中表现为去甲基化状态,LST中IGR-DMP的低甲基化可能导致转录因子功能失调8、LST、PA和CRC之间DMP与信号通路的富集状态通过Venn图显示了LST、PA和CRC叁者共同重迭的DMP部分,其中有435个基因包含超甲基化DMP,而有517个基因包含低甲基化DMP(图13A)。然后,我们以信号通路为切入点,对不同类型肿瘤中的DMP进行了研究,发现与正常样本对照相比,CRC的超甲基化DMP中富集了PI3K-AKT通路,PA的超甲基化和低甲基化DMP均有PI3K-AKT通路富集,同时LST的低甲基化DMP也表现出PI3K-AKT的显着变化;然而在LST和PA之间,我们没有检测到任何共有的常见超甲基化DMP相关通路(图13B)。因此,DNA甲基化的区别在LST和PA之间可能非常明显。这一结果与临床预期的LST和PA之间导致肿瘤转化的分子机制不同是一致的。进一步研究我们发现在8条重要的表观遗传致病通路中,其DNA甲基化表达情况在LST和PA之间相反(图13C)。如MAGI2,PRKCB,FGF12,PDGFD,NGF,PIK3R5,GRIN2A和PDGFRA(图13D)等在Ras和Rap1信号通路所富集的基因在LST中是低甲基化表达而其在PA中却是高甲基化表达。这叁种疾病也存在一些共同的表观遗传靶标基因,包括ECM、ITGA、CCDN1和GF(图15)。PI3K家族的IA因子、P21和FasL均表现出LST特异性的表观遗传学变化。相反,PA则表现出RTK-ERK通路的异常,可能导致细胞增殖、血管生成和DNA修复方面的问题。而蛋白质合成和肿瘤代谢异常是CRC的独特表现。研究结论:1、LST中的DMP在IGR和TSS高度富集,且低甲基化DMP和DMR主要位于IGR。2、LST中低甲基化的IGR-DMP通过影响抑制区的非结肠组织或细胞类型的调节元件,可能导致结肠细胞特异性表型的丧失,并可导致肿瘤组织的形成。3、PI3K-AKT、Ras和Rap1等信号通路所富集的DMP的DNA甲基化表达情况,在LST和PA之间有很大区别,可能是两者在肿瘤转化的分子机制上存在差异的原因之一。4、PI3K家族的IA因子、P21和FasL均表现出LST特异性的表观遗传学变化,而PA则表现出RTK-ERK通路的异常,蛋白质合成和肿瘤代谢异常是CRC的独特表现。5、PI3K-Akt信号通路在LST、PA和CRC发生发展中有独特的表观遗传差异,这对LST、PA和CRC患者都具有非常重要的临床意义,可能成为早期监测标志物、治疗靶点和预后判断的生物标志物。(本文来源于《中国人民解放军海军军医大学》期刊2018-11-01）
杨菊红,林列坤,王一娜,谭鸿熙[3]（2018）在《双特异性磷酸酶-6基因甲基化状态在结肠癌细胞HCT116生长侵袭中的作用》一文中研究指出目的:探讨双特异性磷酸酶-6(dual-specificity phosphatase,DUSP-6)基因甲基化状态对结肠癌细胞HCT116生长侵袭的影响。方法:用甲基化酶抑制剂5-杂氮-脱氧胞苷处理结肠癌HCT116细胞,观察DUSP-6基因甲基化状态、表达变化及其对结肠癌细胞侵袭的影响。结果:5-杂氮-脱氧胞苷处理结肠癌细胞,使原来因基因甲基化而失活的DUSP-6基因去甲基化重新表达,且抑制了结肠癌细胞的侵袭能力。结论:结肠癌HCT116细胞中DUSP-6基因表达与其基因甲基化状态有关,DUSP-6基因去甲基化而高表达,对结肠癌细胞的侵袭能力有抑制作用。(本文来源于《包头医学院学报》期刊2018年06期）
郭添福[4]（2018）在《高覆盖度甲基化重测序解析巴马香猪组织和时序特异位点以及基因组全序列关联分析研究F2家系肌纤维性状的遗传机理》一文中研究指出巴马香猪体型小、耐近交,是药理试验、疾病模型构建和异种器官移植的重要模型动物。DNA甲基化在基因的表达调控中发挥着重要作用,是当前的研究热点之一。至今,不同时序年龄巴马香猪不同组织的全基因组高分辨率甲基化研究还未见报道。本试验利用全基因组重亚硫酸盐测序技术研究1岁、4岁和9岁共叁个年龄段巴马香猪公猪的睾丸和肌肉组织,首次以高覆盖度甲基化重测序系统地解析巴马香猪的组织特异和时序特异位点,绘制了巴马香猪睾丸和肌肉组织单碱基高分辨率全基因组甲基化图谱,探讨了DNA甲基化在巴马香猪繁殖功能衰退和肌肉衰老机制,为动物育种和人类医学研究提供重要的理论参考。结果表明,不同年龄段巴马香猪公猪不同组织的全基因组总体甲基化水平约为4.4%,甲基化主要发生在CG环境下,约占70%(mCG/CG),平均占总甲基化水平的89.57%以上(mCG/mG),mCG环境下各染色体的甲基化水平基本一致,CHG和CHH环境的甲基化水平与总体甲基化水平(mC)在不同染色体上的分布趋势一致;各染色体的甲基化水平与染色体长度基本呈反比。不同年龄段、不同组织巴马香猪基因功能区域全基因组甲基化模式相似,基因的内含子区和3’UTR区的甲基化水平最高,5’UTR区最低。不同年龄和不同组织在不同序列环境下的DMRs主要集中在基因间区、基因的内含子区和外显子区,少量分散在其他基因功能区。不同年龄段、不同组织的DMRs长度在各染色体上的分布呈多样性。两种组织的DMRs数量随着年龄的增长呈减少趋势,DMRs的甲基化水平随着年龄的增长先升后降。不同组织间的DMRs数量随着年龄的增长逐渐减少,说明DNA甲基化差异存在时序特异性。不同年龄段睾丸组织的DMRs甲基化水平高于肌肉组织,证实了DNA甲基化存在组织特异性,而且这两种组织间的DMRs甲基化水平差异不随年龄的变化而变化。通过对不同年龄段和不同组织的DMGs进行GO和KEGG分析,富集到了与骨骼肌发育、肌管细胞发育、肌细胞自我调节和甾类激素介导信号等通路。对不同组别DMGs求交集,在肌肉和睾丸组织中我们共鉴定到了3个候选基因:DMD、SGO1和CITED1。对不同组织不同组别的DMGs求交集,得到148个基因,利用STRING数据库进行分析,筛选了4个DMGs:WT1、NCOA1、NR3C1和NEOD4L。这些候选基因可以为后期研究提供重要参考。猪作为人类最主要的肉类来源,研究其肌肉的相关性状,对养猪生产和消费具有重要意义。不同肌纤维类型及其数量显着影响肌肉的色泽、p H值、滴水损失、系水率和嫩度等肉品质性状。本实验室工作团队利用183个微卫星进行了肌纤维性状的全基因组QTL定位,共鉴别出8个基因组显着水平的QTLs,置信区间为11-127c M,在置信区间内包含了成百上千的基因,从中筛选并鉴别因果基因或因果位点已成艰巨挑战。本研究基于前期肌纤维的表型数据、illumina porcine SNP60芯片的基因型数据和已有的重测序数据,采用基因型填充策略对白色杜洛克×二花脸猪资源家系的1020个个体填充到基因组全序列并进行基因组全序列的关联分析,旨在精细定位影响不同肌纤维类型的QTL区域,鉴别影响猪肌纤维类型的关键标记位点并进一步鉴别影响肌纤维类型的因果基因。本研究以19头F0代和98头无亲缘关系个体的深度重测序数据构建基因组全序列单倍型参考库,利用IMPUTE2软件把1020个个体60k芯片单倍型与参考单倍型的LD及IBD关系填充到基因组全序列,共填充了21,624,800个SNPs。经过质控过滤后剩下14,749,450个SNPs,填补精度范围为91%~96%,平均精度为94%。随后利用线性混合模型对其中11项肌纤维表型的100个个体进行基因组全序列的关联分析,共检测出14个分布在14、15和16号染色体的SNPs与I型肌纤维相对面积(I_RA)、单位面积肌纤维根数(FN)和肌纤维总根数(TFN)显着相关。此外,我们在14号染色体上发现同时影响FN和TFN的多效QTL。通过基因筛选,发现3个与FN(ADAM8和BIN1)、TFN(BIN1)和I_RA(FAM105A)最相关的候选基因。本研究采用基因组全序列关联分析定位到3个影响肌纤维类型的QTLs,为下一步在更大样本群中进行重复验证及精细定位肌纤维类型相关基因奠定了坚实基础,为最终优质肉分子育种技术提供了理论依据。(本文来源于《江西农业大学》期刊2018-06-01）
祝海军[5]（2016）在《RRBS数据分析新流程的建立及其在肿瘤细胞中等位基因特异甲基化分析的应用》一文中研究指出DNA甲基化是非常重要的表观遗传修饰之一,在胚胎发育、细胞分化、X染色体失活、基因组印记、肿瘤发生等方面扮演着重要的角色。DNA甲基化谱式异常是肿瘤的重要特征之一,目前在大部分肿瘤细胞中都发现了整体的DNA甲基化水平降低和部分区域的甲基化水平增高,但具体的DNA甲基化异常的分子机制目前尚不清楚。简化的有代表性的重亚硫酸盐测序(RRBS)技术是近年来发明的全基因组水平的DNA甲基化分析技术,但是因为其数据分析的复杂性,现有的分析软件不能完全满足研究的需要。起始性DNA甲基转移酶DNMT3A在肿瘤细胞DNA甲基化谱式异常中的作用并不清楚,我们利用RRBS技术检测了在肺癌细胞A549中过表达DNMT3A之后基因组DNA甲基化的谱式变化。通过完善数据分析流程后,我们发现过表达DNMT3A之后,基因组DNA整体甲基化上升了9.1%,并且这种上升在不同基因特征区域间没有显着差异。另外,起始性的DNA甲基化变化比例并不高,更多的是已有甲基化水平的少量上升,而且重复序列的甲基化水平也呈现与整体相当的上升。进一步区域分析发现,过表达DNMT3A导致一些基因启动子区起始性的高甲基化,包括了RFPL3、 TFAP2E等,可能参与抑制肿瘤细胞的生长。以上结果显示DNMT3A在肿瘤细胞中参与DNA甲基化水平维持,并能调控一些肿瘤相关基因的启动子区甲基化水平。接下来,我们开发了单个分子连续CpG甲基化连锁分析方法,并加入了DNA甲基化与单核苷酸多态性连锁分析以及DNA甲基化与基因表达相关性分析。利用这些分析手段,我们发现肿瘤细胞系中普遍存在等位基因特异的DNA甲基化(ASM)。为了明确这些ASM的具体特征,我们在多种肿瘤细胞系中进行了RRBS检测和数据分析,同时比较了3个公开的人类胎盘RRBS数据,结果发现这些ASM除了已知的印记基因和X染色体失活相关的区域外,存在着大量的功能未知的基因组区域。但是,与胎盘中的结果不同,不同肿瘤细胞中的这些ASM没有共同性,提示其可能只是肿瘤DNA甲基化谱式紊乱的一种表现。为了进一步分析ASM产生和维持的分子机制,我们在肿瘤细胞系中改变维持性或起始性的DNA甲基化系统,包括过表达UHRF1、抑制表达UHRF1和过表达DNMT3A,并引入了DNMT3A基因与组蛋白互作结构域的突变体。通过RRBS检测结合数据分析流程,我们发现UHRF1对于ASM的维持是必须的,而新ASM的产生则需要DNMT3A介导,这种介导与DNMT3A结合组蛋白未修饰H3K4有关。当DNMT3A突变体结合甲基化的H3K4或者不结合H3K4时,产生的新ASM显着增多,推测是导致了起始性的DNA甲基化所致。最后,我们结合了肿瘤细胞RNAseq的基因表达数据,发现肿瘤细胞中的这些ASM与基因表达无明显的相关性。综合以上结果,肿瘤细胞中新发现的ASM与DNA甲基化维持和起始系统相关,但是不具有明确的调控基因表达功能,各种肿瘤细胞特异性极大,可能是肿瘤细胞DNA甲基化谱式紊乱的一种新的特征,是DNA甲基化化酶功能不足的一种表现,进一步的分子机制可以结合临床肿瘤样本开展。综上所述,本研究开发并完善了RRBS检测的数据分析流程,发现DNMT3A在肿瘤细胞中参与DNA甲基化谱式异常调控的证据；同时发现了肿瘤细胞系中大量新的ASM,并对他们的特征与功能进行了初步分析。本研究建立的分析流程可以应用到更多的DNA甲基化调控机制研究中去,本研究的结果可以为进一步阐明肿瘤细胞中DNA甲基化谱式紊乱的分子机制提供帮助。(本文来源于《华东师范大学》期刊2016-04-01）
张松,余坤飞,熊武,袁佛良,吴淑献[6]（2015）在《双特异性磷酸酶-6基因甲基化在鼻咽癌侵袭转移中的作用》一文中研究指出目的探讨双特异性磷酸酶-6(DUSP-6)基因甲基化在鼻咽癌侵袭转移中的作用。方法应用甲基化特异性PCR和逆转录PCR分别检测38例鼻咽癌组织和14例慢性鼻咽炎组织中双特异性磷酸酶-6基因甲基化状态及其m RNA表达情况。结果 38例鼻咽癌组织中有29例发生双特异性磷酸酶-6基因甲基化,14例鼻咽部慢性炎症组织中无一例发生双特异性磷酸酶-6基因甲基化。DUSP-6基因甲基化在鼻咽癌各分期中差异无统计学意义(χ2=3.217,P=0.105>0.05),而在有淋巴结转移的鼻咽癌组织中DUSP-6基因甲基化(24/26)明显高于无淋巴结转移(5/12)的鼻咽癌组织,差异有统计学意义(χ2=13.216,P=0.000<0.05)。甲基化的鼻咽癌组织中双特异性磷酸酶-6弱或无表达,非甲基化的鼻咽癌组织和慢性鼻咽炎组织中双特异性磷酸酶-6强表达。结论鼻咽癌中双特异性磷酸酶-6表达与其基因甲基化状态有关,双特异性磷酸酶-6基因甲基化可能是鼻咽癌侵袭转移的重要因素。(本文来源于《中国实用医药》期刊2015年31期）
侯建永,陈慧婷,李娟,刘素娜,张红义[7]（2015）在《采用MeDIP-seq检测二氧化硅诱导的肺成纤维细胞转分化前后的特异甲基化改变》一文中研究指出【目的】采用MeDIP-seq的方法检测二氧化硅诱导的肺成纤维细胞转分化前后的特异甲基化改变,探讨表观遗传学变化在肺成纤维细胞转分化过程中的机制。【材料和方法】使用组织块法取SD大鼠肺成纤维细胞进行原代培养至6-8代,肺灌洗方法取SD大鼠肺巨噬细胞,对2种上述细胞使用transwell进行体外共培养,构建体外矽肺模型。同时设立叁个不同的实验组,A1组即对照组(0小时组)、A2即24小时组、A3即48小时组,并对叁个组进行游离SiO2的染毒处理,浓度为100ug/ml,分别在0小时、24小时和48小时收取肺成纤维细胞。将收取的细胞使用MeDIP-seq进行高通量的DNA甲基化测序。【结果】通过测序,得到2G以上的数据:叁个组分别有26048428(60.90%),34162578(61.53%),33314252(60.18%)的reads比对到Ensembl数据库大鼠参考基因组上,分别有22192364(85.20%)、28930222(84.68%)、28256146(84.82%)的reads比对到参考基因唯一位置上。唯一比对上的reads主要分布在基因间区和内含子区域,分别有1.47%、1.40%、1.66%的唯一比对上的reads分布在CpG岛区域。统计不同组别peak在基因不同功能元件上的分布,结果表明,分别有208253、206685、232504个peak位于基因的功能元件上。在各功能元件上,绝大部分peak位于基因间区和内含子区域,有2.66%、2.69%、2.54%的peak位于CpG岛上。按照筛选标准:p(本文来源于《中国毒理学会第七次全国毒理学大会暨第八届湖北科技论坛论文集》期刊2015-10-25）
薛鹏[8]（2015）在《DNA甲基化参与调控Dazl生殖特异表达及其与男性生精障碍和肿瘤的相关性研究》一文中研究指出DAZL是高度保守的DAZ(Deleted in Azoospermia)家族成员之一,定位于脊椎动物的常染色体,在PGC发育迁移、精原细胞分化、减数分裂起始及发展等过程中起重要作用,人DAZL蛋白可以促进胚胎干细胞分化为精子,是配子生成的重要调控因子。DAZL同源基因在从硬骨鱼到人类几乎所有物种的生殖细胞中特定表达,其表达持续存在于胚胎干细胞(ESCs)直至单倍体圆形精子。是什么机制调控了Daz1高度时空特异性表达?这是我们面临的科学问题,DNA甲基化在内的表观遗传修饰是可能的表达调控机制。精子形成过程中,存在原始生殖细胞甲基化信息广泛擦除和随后生殖细胞甲基化的重新建立,这对保障精子的正常发育起重要作用,异常的表观遗传修饰尤其是DNA甲基化可能是导致男性生精障碍及精子活力下降的机制之一。生精相关基因Daz1启动子甲基化模式异常改变是否与男性生精障碍存在关联?部分生殖特异表达基因在人类体细胞恶性肿瘤中异常激活称为癌-生殖基因,研究生殖特定基因Daz1的表达调控机制以及鉴定癌-生殖基因能够为恶性肿瘤相关基础研究提供帮助。本研究分二部分：一、DNA甲基化参与调控Daz1生殖特异表达及其在物种间进化上的保守性该部分研究首先检测了Daz1在小鼠睾丸和体细胞组织中的表达差异,进而测定Daz1启动子CpG岛在不同组织类型中的甲基化模式,分析小鼠Daz1启动子甲基化模式与Daz1特定表达的关系；进一步研究了解小鼠精子发生不同阶段中Daz1表达是否和其甲基化模式存在关联；在体细胞系(NIH3T3)中采用5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理去甲基化后检测Daz1表达情况；在其他哺乳动物和脊椎动物中选取不同物种进行研究,了解Daz1转录调控机制在进化上的保守性;设定计算法对Daz1启动子区域进行生物信息学分析,预测可能的转录因子结合位点。通过以上实验力图阐明Daz1生殖特异表达的转录调控机制。成果如下：1.小鼠Daz1基因表达存在时空特异性通过qRT-PCR方法检测Daz1在成年雄性小鼠睾丸、肝脏、心脏、肠管、脾脏、肌肉、肾脏、胸腺、肺及脑组织中的表达。在体细胞组织中没有检测到Daz1mRNA的表达,而在小鼠睾丸中高表达。继续用qRT-PCR方法检测Daz1在生后3天、6天、8天、12天、14天、16天、18天、20天、21天、5周小鼠睾丸中的表达。在不同发育阶段的小鼠睾丸中,Daz1在3日龄小鼠睾丸中检测出表达,于出生后16-18天时达到峰值,其后有所降低。实验室前期进行的小鼠睾丸冰冻切片免疫组化实验表明Daz1在精原细胞、前细线期精母细胞、偶线期精母细胞和早-中粗线期精母细胞中高表达,此后表达渐减少,在圆形精子中有少量表达,于长形精子中未检测到。通过以上研究,表明Daz1基因表达模式具有高度时空特异性。2.小鼠Daz1启动子CpG岛的甲基化模式与基因表达呈现显着负相关我们运用Methyl Primer Expresss V1.0软件对Daz1启动子进行分析,预测出相应区域CpG岛,采用亚硫酸氢盐修饰后测序PCR(Bisulfite sequencing PCR, BSP)法,分别检测不同组织细胞类型Daz1启动子CpG岛的甲基化状态。结果显示：在成年小鼠体细胞组织(肾脏、脑)中Daz1启动子CpG岛高度甲基化,而在睾丸中Daz1启动子CpG岛呈现低甲基化模式,附睾精子中甲基化程度相较睾丸组织更低。Daz1启动子CpG岛的甲基化模式与其表达情况呈现明显的负相关,提示Daz1启动子区域甲基化可能参与了Daz1生殖细胞特异性表达的调控。通过对小鼠出生后不同时间点睾丸中Daz1启动子CpG岛的甲基化检测,我们发现Daz1启动子区域在小鼠6-8日龄以及10-12日龄呈现低甲基化状态,而在出生后20-24天表现为甲基化程度升高,这一结果与小鼠Daz1表达于精原细胞、持续到圆形精子、以及后续阶段的表达降低相一致。以上相关性结果提示DNA甲基化参与调控了小鼠Daz1时间(精子发生阶段)空间(生殖细胞)特异性的表达。3.体细胞中进行去甲基化处理激活Daz1异常表达上述实验显示小鼠Daz1表达与其启动子甲基化状态呈现显着负相关关系,提示DNA甲基化参与调控小鼠Daz1的时空特异表达,那么在Daz1不表达的体细胞中采用药物去甲基化是否能够诱导Daz1异常激活?为此,我们采用甲基化抑制剂5-Aza-CdR在体细胞系进行去甲基化处理,通过qRT-PCR检测5-Aza-CdR处理后Daz1 mRNA的水平。结果显示Daz1在去甲基化处理后的体细胞中表达升高,作为对照的Tex19.1和RHOX2亦异常升高,而DAZ家族另一成员Boule却无明显变化。这一结果提示体细胞中Daz1的表达沉默由其基因启动子甲基化模式调控,而Boule表达调控机制可能更为复杂多元。4.DNA甲基化机制参与调控Daz1生殖特异表达在物种进化上存在高度保守性。实验采用qRT-PCR对收集的人睾丸及体细胞组织(结肠、前列腺、胃、胆囊及脾脏)DAZL mRNA表达水平进行检测,结果显示DAZL mRNA在人睾丸组织中高表达,而在体细胞组织中不表达。进一步研究DAZL启动子甲基化模式是否与此相关,实验提取人睾丸、精子、体细胞组织(前列腺、脾脏)DNA进行甲基化检测,发现在体细胞组织中DAZL启动子为高甲基化状态而在睾丸中显示为低甲基化,精子中显示为更低的甲基化程度。相似的实验结果在另一种哺乳动物猪中同样存在,表明DNA甲基化机制参与调控Daz1生殖特异表达存在于哺乳动物中。鉴于Daz1最早表达于脊椎动物生殖细胞,我们进一步实验了解这一调控机制在进化上是否在更低级别的脊椎动物中存在。我们提取了斑马鱼和莱航鸡性腺及体细胞组织的RNA及基因组DNA,实验结果显示Daz1 mRNA在性腺中高表达而Daz1启动子呈低甲基化状态,体细胞组织中Daz1启动子呈高甲基化而无Daz1 mRNA表达。Daz1同源基因表达从硬骨鱼类开始出现到哺乳动物直至人类,以上实验表明启动子区差异化的甲基化模式参与调控Daz1生殖特异性表达,支持这一调控机制古老并且在物种进化上维持保守性的假说。5. Daz1启动子区转录因子可能结合位点的生物信息学预测分析预测转录因子结合位点是研究基因转录调控的重要组成部分。前述研究明确了Daz1在生殖细胞和体细胞中差异化的甲基化模式和其生殖特异表达密切相关,且这种关联贯穿Daz1整个基因进化历程,表明DNA甲基化调控机制在Daz1基因表达调控中保守存在。那么,Dazl启动子区域是否存在保守的顺式作用元件参与基因的转录调控?我们检索人、小鼠、猪及大鼠Dazl Exonl上游3.5kb的序列,设定计算法检测长度大于7个碱基的保守序列,结果显示在上述物种中共同存在12个由7个核苷酸组成的相同序列,数据库检索发现这些保守存在的相似序列可能是一些转录因子的结合位点。二、DAZL表达调控异常与男性生精障碍及肿瘤相关性研究。1.DAZL启动子异常的甲基化模式与男性生精障碍有关。精子发生过程经历了基因组范围内的去甲基化和重新甲基化过程,男性精子甲基化的研究工作将从表观遗传学角度为男性生精障碍临床诊疗提供帮助。为此,我们比较了正常男性与少弱精子症患者精子DAZL启动子甲基化谱差异。收集精液标本后进行精液常规检查和精子形态测定；采用密度梯度离心法去除体细胞污染,提取精子基因组DNA；亚硫酸氢盐处理后PCR体外扩增并纯化,与pCR2.1载体连接及酶切验证,挑取阳性克隆测序；分析不同样本精子DNA甲基化程度差异。和对照相比,少弱精症患者DAZL启动子甲基化率明显升高,结果存在统计学差异。这一结果提示DAZL启动子区异常的甲基化模式可能与男性生精障碍有关。2.DAZL在部分恶性肿瘤中异常表达。癌-生殖基因或癌-睾丸基因是指一类其抗原蛋白表达于人类多种组织来源恶性肿瘤,而在正常组织中只存在于睾丸、卵巢或胎盘组织。上研究显示Dazl生殖细胞特定表达与其基因调控区甲基化模式差异密切相关,其是否类似于癌-生殖基因在恶性肿瘤中异常表达?我们在TCGA数据库中搜索发现DAZL在头颈部肿瘤、肺癌和乳腺癌中表达,尤其在后者中表达较明显。但和其他经典癌-生殖基因相比,DAZL在肿瘤中表达量仍较低,提示DAZL在部分肿瘤中异常表达可能和肿瘤细胞基因组整体异常低甲基化有关。(本文来源于《南京医科大学》期刊2015-10-01）
张兰,陆璐,杨翠翠,蔡彦宁,李林[9]（2015）在《衰老小鼠不同组织时钟基因启动子甲基化修饰的特异性改变及中药有效成分的调控作用》一文中研究指出目的:为了探索时钟基因启动子甲基化在衰老中的作用,对小鼠不同组织八种时钟基因启动子甲基化修饰进行检测,研究时钟基因启动子发生甲基化频率随增龄的特异性改变并观察中药有效成分二苯乙烯苷(2,3,5,4'-TTetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside,TSG)和淫羊藿苷(icarrin,ICA)对不同组织时钟基因启动子甲基化的影响。从表观遗传学角度,探究药物是否通过调节时钟基因启动子甲基化从而影响衰老及相关疾病的发生发展,为发现抗衰老药物干预新靶点提供可能。方法:自然衰老C57BL小鼠,分为4月龄青年组,20月龄老年模型组,灌胃TSG或ICA3个月至20月龄的给药组。小鼠麻醉后处死,分别取胃、血管、脾、纹状体及肾组织,液氮中速冻后,-80℃保存。提取组织DNA,对基因组DNA进行偏重亚硫酸盐处理后应用甲基化特异性聚合酶链反应(Methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)方法检测八种时钟基因(Perl、Per2、Bmall、Bmal2、Cryl、Cry2、Clock、Npas2)启动子甲基化水平。SssI甲基转移酶(New England Biolabs,UK)处理的基因组DNA作为阳性对照,未经偏重亚硫酸盐处理的DNA作为阴性对照。结果1.衰老小鼠脾组织时钟基因Cryl、Bmal2和Npas2启动子区均存在甲基化,青年小鼠脾中未发现上述基因启动子区甲基化,两组间均有显着性差异。衰老小鼠胃组织时钟基因Perl启动子甲基化频率与青年组相比显着降低。衰老小鼠血管组织时钟基因Bmal1启动子甲基化频率与青年组相比明显升高,但无统计学差异。纹状体和肾组织中,八种时钟基因启动子甲基化频率两组间均无明显差异。2.中药有效成分二苯乙烯苷(TSG)对衰老小鼠脾组织Cryl启动子区甲基化频率的增高有显着的下调作用。TSG还明显下调血管Bmal1启动子甲基化频率。3.中药有效成分淫羊藿苷(ICA)对衰老小鼠脾组织Cryl基因启动子区甲基化频率的增高也有显着的下调作用。ICA对衰老小鼠胃组织Perl基因启动子区甲基化频率的降低有明显的升高。4.TSG和ICA对纹状体及肾组织中八种时钟基因启动子甲基化频率无明显调节作用。结论1.本实验建立了一种高效、经济、准确检测小鼠不同组织八种时钟基因启动子甲基化水平的方法。2.衰老小鼠不同组织时钟基因甲基化存在着显着差异,说明时钟基因启动子甲基化有一定的组织特异性。Cry1、Per1、Bmall、Bmal2和Npas2启动子甲基化可能与衰老及相关疾病的发生发展密切相关。3.中药有效成分TSG和ICA对时钟基因启动子甲基化具有调节作用。4.Cry1,Per1与Bmal1等时钟基因启动子的甲基化调节可能成为抗衰老药物新的干预靶点。(本文来源于《第十二次全国中西医结合实验医学专业委员会暨第七次湖南省中西医结合神经科专业委员会学术年会论文集》期刊2015-07-10）
张兰,陆璐,杨翠翠,蔡彦宁,李林[10]（2015）在《衰老小鼠不同组织时钟基因启动子甲基化修饰的特异性改变及中药有效成分的调控作用》一文中研究指出目的为了探索时钟基因启动子甲基化在衰老中的作用,对小鼠不同组织八种时钟基因启动子甲基化修饰进行检测,研究时钟基因启动子发生甲基化频率随增龄的特异性改变并观察中药有效成分二苯乙烯苷(2,3,5,4'—Tetrahydroxystilbene—2—O—β—D—glucoside,TSG)和淫羊藿苷(icarrin,ICA)对不同组织时钟基因启动子甲基化的影响。从表观遗传学角度,探究药物是否通过调节时钟基因启动(本文来源于《第四届全国痴呆与认知障碍学术研讨会及高级讲授班论文汇编》期刊2015-05-22）
甲基化特异的法论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
研究目的:1、探索结直肠侧向发育型肿瘤(laterally spreading tumor,LST)的DNA甲基化特征,尤其是对通常容易被忽略的基因组区域进行分析。2、探索LST和隆起型腺瘤(protruded-type adenoma,PA)之间主要的DNA甲基化差异。3、通过全基因组DNA甲基化分析来探讨LST在常见信号通路中的特异性表观遗传变异。研究方法:1、选取入组患者和采集样本2、甲基化450k芯片检测3、差异性甲基化位点(differentially methylated position,DMP)和差异性甲基化区域(differentially methylated region,DMR)的筛选使用配对t检验比较LST组与对照组β值的差异。应用Bonferroni校正后的q值<0.05,从每组配对比较中筛选LST相关的DMP。利用minfi软件包对DMP的潜在区域聚类进一步分析,确定所组成DMR。4、DMP的分布分析按所处的基因组区域、染色体位置对DMP进行分层,并在450k芯片中与各自分层相关的区域、位置进行比较。因样本量较小,我们使用Fisher’s独立精确检验来分析特定的基因组区域、染色体位置的DMP数量与预期值的差异是否存在统计学意义。然后再对超甲基化DMP与低甲基化DMP的数量比进行Fisher’s精确检验,以评估其是否在每个基因组区域、染色体位置中的分布差异都存在统计学意义。统计学检验水准设定为经Bonferroni校正的α=0.05。5、焦磷酸测序验证本实验在10组含正常黏膜对照的病例样本中进行研究,另外新增加了9组相同入组标准的病例样本以进行芯片检测结果验证。验证方法为焦磷酸测序。6、基因本体(Gene Ontology,GO)和通路富集分析7、组蛋白修饰富集分析8、公共数据的下载及标准化从NCBI基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)下载经过处理的DNA甲基化数据GSE48684。另从GEO下载了一套11对LST和匹配的正常结直肠粘膜的DNA甲基化数据和表达分析数据GSE77635。使用RNA-seq TMM方法标准化处理,来量化转录因子和与IGR DMP和DMR相关的最近基因的表达水平。9、使用18态ChromHMM模型计算DMP和DMR的观察值和预期值18态的ChromHMM模型从依据hg19标准人类基因组数据的Roadmap表观基因组计划数据库中下载。使用自定义R代码来计算表观基因组n中状态m的DMP和DMR预期总数,然后将研究中观察到的表观基因组n中状态m的DMP和DMR总数,与预期总数进行比较(具体公式详见正文部分)。10、识别转录因子结合位点(transcription factor binding site,TFBS)的富集从hg19人类基因组数据集中获得了抑制区DMP的基因组序列,并将DMP、DMR和450k探针的检测区间扩展到1000bp。利用MEME套件中的FIMO工具,使用默认脊椎动物数据库进行富集的结合模体查找分析,设定其检验水准q值(经FDR校正的p值)为0.05,当目标序列与背景序列的比值>1.1,定义为转录因子结合模体的显着富集。11、辅助数据的可用性本研究相关数据已保存在NCBI的基因表达综合数据库中,登记号为GSE106556。研究结果:1、在LST中发现DMP与DMR并验证我们首先明确了LST的DNA甲基化异常特点。经严格分析并采用必要的统计学校正方法(Bonferroni校正P<0.05,图3A)计算分析,确定了10个LST样本中2452个DMP。同时多个染色体的DMP分布差异也具有显着的统计学意义,特别是chrX(P<3.37×10~(-18),Fisher’s精确检验)和chr 8(P<1.85×10~(-16),Fisher’s精确检验)。值得注意的是,我们发现了1925个低甲基化的DMP(78.51%)显着高于527个超甲基化的DMP(21.49%)(图3B)。然后,利用minfi软件包分析确定了DMR,明确了73个超甲基化DMR和13个低甲基化DMR。随后我们使用焦磷酸测序方法,在研究组及另外9组新病例样本中,验证了位于不同基因组区域的4个位点(P值较小,差异性较大的位点)的甲基化水平(图4),结果发现所有4个位点在各样本中均显示出与450k芯片一致的差异性甲基化状态。2、DMP在IGR和TSS高度富集3、LST在TSS周围表现出显着的DNA甲基化异常4、IGR是LST的DNA甲基化水平异常的热区5、IGR的潜在功能研究发现“消化系统发育”是低甲基化的IGR-DMP调控的重要生物学功能,其中包括许多重要的发育转录因子,如TGFB2,FOXF1,FOXF2,GATA4,FGF10和FGF9(图8A)。研究同时发现,低甲基化的IGR-DMP与参与组蛋白去乙酰化的基因(HDAC2,HDAC4,HDAC9,NACC2,SALL1和SUDS3)(图8A)相关(组蛋白去乙酰化,-log10(P-值)=4.97)。该结果表明LST发生过程中DNA甲基化和组蛋白修饰之间存在相互作用的可能性。6、组蛋白H3K9me3在IGR-DMP高度富集7、正常粘膜的抑制区在LST中表现为去甲基化状态,LST中IGR-DMP的低甲基化可能导致转录因子功能失调8、LST、PA和CRC之间DMP与信号通路的富集状态通过Venn图显示了LST、PA和CRC叁者共同重迭的DMP部分,其中有435个基因包含超甲基化DMP,而有517个基因包含低甲基化DMP(图13A)。然后,我们以信号通路为切入点,对不同类型肿瘤中的DMP进行了研究,发现与正常样本对照相比,CRC的超甲基化DMP中富集了PI3K-AKT通路,PA的超甲基化和低甲基化DMP均有PI3K-AKT通路富集,同时LST的低甲基化DMP也表现出PI3K-AKT的显着变化;然而在LST和PA之间,我们没有检测到任何共有的常见超甲基化DMP相关通路(图13B)。因此,DNA甲基化的区别在LST和PA之间可能非常明显。这一结果与临床预期的LST和PA之间导致肿瘤转化的分子机制不同是一致的。进一步研究我们发现在8条重要的表观遗传致病通路中,其DNA甲基化表达情况在LST和PA之间相反(图13C)。如MAGI2,PRKCB,FGF12,PDGFD,NGF,PIK3R5,GRIN2A和PDGFRA(图13D)等在Ras和Rap1信号通路所富集的基因在LST中是低甲基化表达而其在PA中却是高甲基化表达。这叁种疾病也存在一些共同的表观遗传靶标基因,包括ECM、ITGA、CCDN1和GF(图15)。PI3K家族的IA因子、P21和FasL均表现出LST特异性的表观遗传学变化。相反,PA则表现出RTK-ERK通路的异常,可能导致细胞增殖、血管生成和DNA修复方面的问题。而蛋白质合成和肿瘤代谢异常是CRC的独特表现。研究结论:1、LST中的DMP在IGR和TSS高度富集,且低甲基化DMP和DMR主要位于IGR。2、LST中低甲基化的IGR-DMP通过影响抑制区的非结肠组织或细胞类型的调节元件,可能导致结肠细胞特异性表型的丧失,并可导致肿瘤组织的形成。3、PI3K-AKT、Ras和Rap1等信号通路所富集的DMP的DNA甲基化表达情况,在LST和PA之间有很大区别,可能是两者在肿瘤转化的分子机制上存在差异的原因之一。4、PI3K家族的IA因子、P21和FasL均表现出LST特异性的表观遗传学变化,而PA则表现出RTK-ERK通路的异常,蛋白质合成和肿瘤代谢异常是CRC的独特表现。5、PI3K-Akt信号通路在LST、PA和CRC发生发展中有独特的表观遗传差异,这对LST、PA和CRC患者都具有非常重要的临床意义,可能成为早期监测标志物、治疗靶点和预后判断的生物标志物。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
甲基化特异的法论文参考文献
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[4].郭添福.高覆盖度甲基化重测序解析巴马香猪组织和时序特异位点以及基因组全序列关联分析研究F2家系肌纤维性状的遗传机理[D].江西农业大学.2018
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[10].张兰,陆璐,杨翠翠,蔡彦宁,李林.衰老小鼠不同组织时钟基因启动子甲基化修饰的特异性改变及中药有效成分的调控作用[C].第四届全国痴呆与认知障碍学术研讨会及高级讲授班论文汇编.2015