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重组杆状病毒介导甲型H1N1流感基因工程疫苗研究

2020-12-17阅读(601)

重组杆状病毒介导甲型H1N1流感基因工程疫苗研究

论文摘要

流感是一种急性的经呼吸道传染的疾病,无论是对动物养殖业还是人类健康均造成严重的危害。2009年4月,墨西哥、美国等国家相继爆发了猪源甲型H1N1流感的疫情,之后迅速蔓延至全球范围内的许多国家和地区。同年6月,世界卫生组织将此次流感流行的预警级别提升至6级。针对如此大的疫情,疫苗接种是预防和控制流感流行最有效的方法,流感病毒灭活疫苗是目前用于预防流感最为广泛的疫苗。尽管灭活疫苗保护率较好,但仍存在着不足,如制备周期较长、需要大量鸡胚,另外少数个体在疫苗接种后会产生不良反应。因此,科研工作者一直在试图研制一种更安全、更高效的流感疫苗。杆状病毒一直被用于在昆虫细胞中表达外源蛋白。最近的研究报道,表明杆状病毒载体在真核生物启动子的驱动下可以转导不同类型的哺乳动物细胞并表达外源基因,同样基因在不同启动子的控制下,其表达水平也会有很大的差异,且经水泡性口膜炎病毒G蛋白（VSV/G）修饰的杆状病毒,其宿主范围更广,在哺乳动物细胞中的转导效率更高。鉴于此,本研究对甲型H1N1流感基因工程疫苗进行新的探索,构建了两种启动子驱动甲型H1N1流感免疫原性蛋白表达的重组杆状病毒疫苗,并在小鼠模型上对所构建的疫苗进行免疫效力评价,主要研究内容如下：1重组杆状病毒BV-CMV-HA/M1/NA和BV-ie1-HA/M1/NA的构建利用对虾白斑综合症病毒（white spot syndrome virus, WSSV）的iel启动子和人巨细胞病毒的CMV启动子分别构建了囊膜表面展示有VSV-G蛋白重组杆状病毒,两种启动子驱动的重组杆状病毒都介导甲型H1N1流感新型基因工程疫苗BV-CMV-HA/M1/NA和BV-ie1-HA/M1/NA。2多克隆抗体的制备和重组杆状病毒BV-CMV-HA/M1/NA、BV-ie1-HA/M1/NA的体外表达分析在HA序列的基础上,设计引物扩增HA的亚基（tHA1）,用基因工程方法,构建原核表达质粒pET28a-tHA1,将原核表达质粒pET28a-tHA1转化大肠杆菌BL21（DE3）细胞,通过IPTG诱导获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。将重组蛋白tHA1进行SDS-PAGE电泳,将目的蛋白从蛋白胶上割下,称量,用研钵研磨至糊状后在小鼠背部多点皮下注射,注射剂量为200uL。间隔两周,再次同上方法注射,后每周加强免疫一次,并每周采血检测抗体,至抗体符合要求时,即对小鼠进行眼眶采血大量收集血清,即为鼠源多克隆抗体。为证实重组杆状病毒在体内能否有效表达外源蛋白,将重组杆状病毒BV-CMV-HA/M1/NA和BV-ie1-HA/M1/NA转导BHK-21细胞,IFA试验表明,重组杆状病毒BV-CMV-HA/M1/NA和BV-ie1-HA/M1/NA均能够在体外表达外源蛋白。3重组杆状病毒BV-CMV-HA/Ml/NA和BV-iel-HA/Ml/NA在小鼠体内诱导的免疫原性评价为探讨重组杆状病毒疫苗的免疫效果,以1×109PFU/只的剂量免疫BLAB/c小鼠,同时用甲型H1N1流感病毒灭活疫苗做对照。结果表明：在细胞免疫方面,两种重组杆状病毒均产生了较好的体液免疫水平,另外灭活疫苗也产生了较好的体液免疫水平。在细胞免疫方面,检测了IFN-y的转录和蛋白表达水平,实验结果表明,重组杆状病毒疫苗诱导了较好的细胞免疫,灭活疫苗诱导的细胞免疫水平相对于重组杆状病毒疫苗组则较低。4鼠肺适应甲型H1N1流感病毒株的制备和重组杆状病毒BV-CMV-HA/M1/NA、BV-ie1-HA/Ml/NA在小鼠体内诱发的保护性免疫用乙醚将小鼠麻醉,将甲型H1N1流感病毒（A/wuhan/10/2010）在小鼠肺脏中传代,使之成为能致死小鼠的鼠肺适应甲型H1N1流感病毒株。攻毒结果进一步表明,重组杆状病毒疫苗和灭活疫苗在小鼠体内诱导的免疫反应均能有效抵抗致死剂量的甲型H1N1流感病毒的攻击。为发展安全有效的甲型H1N1流感疫苗奠定了基础。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第1章 文献综述
  • 1.1 甲型H1N1流感概述
  • 1.1.1 甲型H1N1流感的公共卫生
  • 1.1.2 基因组编码蛋白的功能
  • 1.1.3 流感疫苗的研究进展
  • 1.2 杆状病毒简介
  • 1.2.1 杆状病毒表达系统
  • 1.2.2 杆状病毒作为哺乳动物细胞表达载体在疫苗研究中的应用
  • 第2章 目的与意义
  • 第3章 材料与方法
  • 3.1 材料
  • 3.1.1 病毒、细胞和菌株
  • 3.1.2 载体与质粒
  • 3.1.3 工具酶及主要试剂
  • 3.1.4 培养基及抗生素的配制
  • 3.1.5 主要缓冲液与相关试剂及其配制
  • 3.1.5 主要缓冲液与相关试剂及其配制
  • 3.1.6 其它缓冲液及试剂
  • 3.1.7 实验动物及鸡胚
  • 3.2 试验方法
  • 3.2.1 限制性内切酶酶切反应
  • 3.2.2 酶切产物的电泳检测
  • 3.2.3 酶切产物回收与纯化
  • 3.2.4 连接反应
  • 3.2.5 感受态细胞的制备
  • 3.2.6 连接产物的转化
  • 3.2.7 质粒的小量制备
  • 3.2.8 重组Bacmid DNA的提取及鉴定
  • 3.2.9 重组杆状病毒获得
  • 3.2.10 tHHA1蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备
  • 3.2.11 重组杆状病毒转导哺乳动物细胞
  • 3.2.12 间接免疫荧光试验（IFA）检测目的蛋白的体外表达
  • 3.2.13 甲型H1N1流感病毒（IAV）的培养
  • 3.2.14 血凝素凝集（HA）效价的测定
  • 3.2.15 病毒组织半数感染剂量测定（TCID50）
  • 3.2.16 IAV灭活疫苗的制备
  • 3.2.17 动物免疫
  • 3.2.18 微量中和试验
  • 3.2.19 血凝抑制试验
  • 3.2.20 ELISA的操作步骤
  • 3.2.21 样品总RNA的提取
  • 3.2.22 细胞免疫的检测
  • 3.2.23 IAV小鼠肺脏适应株的制备
  • 3.2.24 小鼠半数致死量（MLD50）测定
  • 3.2.25 小鼠的攻毒保护性试验
  • 第4章 结果与分析
  • 4.1 重组杆状病毒的构建
  • 4.1.1 穿梭质粒Bacmid-CMV-HA/M1/NA和Bacmid-ie1-HA/M1/NA的构建
  • 4.1.2 重组杆状病毒的制备
  • 4.1.3 重组杆状病毒的扩大、纯化和滴度测定
  • 4.2 THA1蛋白的表达纯化及多克隆抗体的制备及重组杆状病毒体外表达的检测
  • 4.2.1 tHA1蛋白的表达纯化及多克隆抗体的制备
  • 4.2.2 重组杆状病毒体外表达的检测
  • 4.3 重组杆状病毒在小鼠体内诱导的免疫原性评价
  • 4.3.1 重组杆状病毒在小鼠体内诱发的体液免疫
  • 4.3.2 重组杆状病毒在小鼠体内诱发的细胞免疫
  • 4.4 重组杆状病毒在小鼠体内诱导的保护性免疫
  • 4.4.1 攻毒后小鼠的临床症状及体重变化
  • 4.4.2 攻毒后小鼠的存活率
  • 第5章 讨论与结论
  • 5.1 讨论
  • 5.1.1 重组杆状病毒的构建
  • 5.1.2 重组杆状病毒在小鼠体内诱导的免疫原性反应
  • 5.1.3 重组杆状病毒在小鼠体内诱导的保护性免疫
  • 5.1.4 重组杆状病毒在病毒载体疫苗研制中的前景
  • 5.2 结论
  • 参考文献
  • 致谢

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