烟草转基因研究及其品系的选育

论文摘要

花发育机制是当前植物分子生物学研究的热点之一,也是植物分子育种的基础之一。烟草是花发育研究的模式植物,其花发育的研究以及通过转基因手段获得变异植株,为花发育的基础研究奠定基础。本试验选取野生型烟草,以根癌农杆菌EHA105菌株为介导,将干涉PMADS3基因C和M区的基因片段,以叶盘转化法转化烟草,获得转基因植株,并从形态、分子和遗传方面分析外源基因对植物花型的影响,为其基因的功能研究提供依据。应用实验室保存的转基因烟草,通过杂交和重复转化的方法,初步研究了烟草的多基因转化。通过早花烟草的品系选育,创造出新的烟草品系,为进一步研究外源基因的功能及遗传提供可用材料。主要结果如下：1.通过农杆菌介导的叶盘转化法,转干涉C和M区基因片段的烟草有明显重瓣现象,与野生型相比,转基因烟草花型发生了变化,表现为3种重瓣强度：仅花药瓣化、部分花丝瓣化和全部花丝瓣化。对T0代和T1代进行PCR检测到阳性植株,说明外源基因的导入引起的花型变化可以通过自交遗传给下一代。2.初步验证杂交可以实现多基因转化。以实验室保存的转PFT基因和FBP21基因的早花烟草分别为母本和父本进行杂交,对F1和F2代烟草植株的抗生素筛选和PCR检测结果发现,部分植株同时存在两种抗性基因,且杂交后代的花色、花型和果实形状出现了介于父母本之间的表型。3.初步验证重复转化法可以实现多基因转化。以实验室保存的转paFT基因的早花烟草为受体,转入GUS报告基因,通过对TO代和T1代的GUS染色、株高花期观测和PCR检测,得到了同时表达两个外源基因的T1代转基因烟草。但是与单基因转化相比,重复转化法的转化效率较低。4.对实验室已有的红花早花和白花早花烟草,进行系谱法选育。通过对红花早花T3和T4代的表型观测发现,早花性状能稳定遗传。白花早花T1和T2代的的性状分离情况比较复杂,还需要后期继续选育。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 高等植物花发育及花色研究
• 1.1.1 花发育的基因调控
• 1.1.2 开花时间相关基因的结构特征与作用机制
• 1.1.2.1 花序分生组织特异基因
• 1.1.2.2 花分生组织特异基因
• 1.1.2.3 开花整合基因
• 1.1.3 花型基因工程研究进展
• 1.1.4 花色基因工程研究进展
• 1.1.4.1 影响植物花色的因素
• 1.1.4.2 花色基因工程和植物MYB转录因子研究进展
• 1.2 多基因转化研究进展
• 1.2.1 杂交方法
• 1.2.2 重复转化法
• 1.2.3 共转化方法
• 1.2.4 利用叶绿体转化技术进行多基因转化
• 1.2.5 利用内部核糖体进入位点进行多基因转化
• 1.3 外源基因在转基因植物中的表达和稳定性研究进展
• 1.3.1 外源基因的表达与沉默
• 1.3.2 植物生长发育情况和外界环境对外源基因表达的影响
• 1.4 本研究的目的及意义
• 2 重瓣基因的烟草转化
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.2 试验方法
• 2.2.2.1 包含C和MA基因片段农杆菌的保存与活化
• 2.2.2.2 烟草的遗传转化
• 2.2.2.3 转基因烟草植株的田间种植
• 2.2.2.4 转基因烟草植株的PCR检测
• 2.2.2.5 转基因烟草植株花型变化的观测
• 2.2.2.6 转基因烟草植株的抗生素筛选
• 1代性状观测'>2.2.2.7 转基因烟草T₁代性状观测
• 2.3 结果与分析
• 0代转基因烟草植株花型及果实外形的观测'>2.3.1 T₀代转基因烟草植株花型及果实外形的观测
• 0代转基因烟草植株的PCR检测'>2.3.2 T₀代转基因烟草植株的PCR检测
• 0代转基因烟草种子及外植体筛选'>2.3.3 T₀代转基因烟草种子及外植体筛选
• 1代植株的PCR检测及花型变化'>2.3.4 转基因烟草T₁代植株的PCR检测及花型变化
• 2.4 讨论
• 2.4.1 选择合适的外植体对转化的影响
• 2.4.2 试管苗移栽前后的管理
• 2.4.3 C和MA基因片段对烟草花型的影响
• 2.4.4 外源基因的转录水平
• 3 多基因转化的初步探索
• 3.1 两种早花烟草的杂交
• 3.1.1 引言
• 3.1.2 材料与方法
• 3.1.2.1 材料
• 3.1.2.2 方法
• 3.1.3 结果与分析
• 3.1.3.1 花粉活力的测定
• 1、F₂代烟草花期、株高等植物学性状的观测'>3.1.3.2 四个杂交组合F₁、F₂代烟草花期、株高等植物学性状的观测
• 1代烟草种子的抗生素筛选'>3.1.3.3 F₁代烟草种子的抗生素筛选
• 2代烟草叶片抗生素筛选'>3.1.3.4 F₂代烟草叶片抗生素筛选
• 1、F₂代烟草植株的PCR检测'>3.1.3.5 F₁、F₂代烟草植株的PCR检测
• 3.1.4 讨论
• 3.1.4.1 多基因转化方法之杂交的可行性
• 3.1.4.2 杂交时需要注意的问题
• 3.1.4.3 杂交后代的性状分离
• 3.2 GUS报告基因转化早花烟草
• 3.2.1 引言
• 3.2.2 材料与方法
• 3.2.2.1 材料
• 3.2.2.2 方法
• 3.2.3 结果与分析
• 0代植株的GUS染色'>3.2.3.1 转基因烟草T₀代植株的GUS染色
• 1代烟草植株的性状观测'>3.2.3.2 T₁代烟草植株的性状观测
• 1代烟草植株的GUS染色和PCR检测'>3.2.3.3 T₁代烟草植株的GUS染色和PCR检测
• 3.2.4 讨论
• 3.2.4.1 多基因转化方法之重复转化的可行性
• 3.2.4.2 重复转化时需注意的问题
• 3.2.4.3 转基因植株表型的稳定性
• 3.2.4.4 转基因植株不同部位的GUS染色表达
• 4 转基因早花烟草品系的选育
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 方法
• 4.2.2.1 自交亲本的选择
• 4.2.2.2 系谱法选育
• 4.2.2.3 花粉生活力测定
• 4.2.2.4 自交后代花期、株高等植物学性状观测
• 4.2.2.5 自交后代PCR检测
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 花粉活力测定结果
• 3代）和白花早花（T₁代）花期、株高等植物学性状'>4.3.2 花早花（T₃代）和白花早花（T₁代）花期、株高等植物学性状
• 4代）和白花早花（T₂代）的性状观察'>4.3.3 红花早花（T₄代）和白花早花（T₂代）的性状观察
• 4.3.4 自交后代PCR检测
• 4.4 讨论
• 4.4.1 转基因早花烟草品系的繁殖与田间管理
• 4.4.2 早花烟草的花粉生活力测定
• 4.4.3 间苗
• 4.4.4 后代表型的稳定性
• 5 结论
• 参考文献
• 附表
• 致谢