盾壳霉T-DNA插入体库的构建及两个分生孢子形成相关基因的克隆

论文摘要

盾壳霉（Coniothyrium minitans）是植物病原真菌核盘菌（Sclerotiniasclerotiorum）的重要生防真菌。本研究以ZS-1菌株为出发菌株,建立了农杆菌介导高效转化盾壳霉的技术体系及克隆相关基因的技术平台,构建了含30500个转化子的T-DNA标记插入转化子库,克隆到2个与产孢相关的基因,现报道如下:对农杆菌转化条件进行了优化,建立了高效转化盾壳霉的技术体系。发现ZS-1菌株的培养时间、用于转化的分生孢子浓度、分生孢子与农杆菌共培养的时间等与转化效率有关。当使用在PDA斜面上培养21d所获得的分生孢子（浓度为108个孢子/ml）与细菌共培养96h后获得的转化效率最高,每皿可以获得500个转化子。建立了以热不对称交错PCR（TAIL-PCR）、反向PCR（iPCR）、逆转录PCR（RT-PCR）、cDNA文库等为基础的克隆基因的技术平台,并利用此技术平台克隆了产孢相关的基因。利用上述转化方法构建了盾壳霉ZS-1菌株的T-DNA插入体库,获得了30500个转化子。自盾壳霉的插入突变体库中共筛选得到了127株产孢缺陷型突变体,其中65株突变体在PDA平皿上不能产生分生孢子,而另外的62株则可以产生少量的孢子。这些产孢缺陷型突变体在菌丝生长速度、产抗生物质、寄生菌核能力和菌落形态等方面存在差异显著性,大多数突变体的T-DNA为单位点插入,且插入位点不同。这即表明盾壳霉的分生孢子形成复杂,受多种基因调控。依据菌落形态,65株完全不产孢的突变体大致可分为7种类型,即Ⅰ类:突变体生长缓慢,菌落不能均匀扩展,共26株;Ⅱ类:突变体生长较缓慢,气生菌丝茂盛,共28株;Ⅲ类:突变体生长正常,但菌落中央的菌丝塌陷,溃解,仅1株;Ⅳ类:突变体生长正常,但与寄主（核盘菌）接触后可以恢复产孢能力,共3株;Ⅴ类:菌丝生长块,甚至超过出发菌株ZS-1,共5株;Ⅵ类:生长缓慢,菌丝稀疏,菌落中有菌丝集结,呈铁锈色,仅1株;Ⅶ类:突变体只能产生分生孢子器而不产生分生孢子,仅1株;另外还有11株菌落形态上没有明显的区别,没有具体的归为哪一类。对产孢缺陷型突变体ZS-1T2029进行了详细的研究。突变体ZS-1T2029在菌丝生长和分泌抗生物质等方面与出发菌株ZS-1相比没有显著差异;此突变体仍具寄生核盘菌的能力,在菌核上可以产生分生孢子,但其寄生腐烂菌核的能力显著下降,显微观察发现ZS-1T2029的分生孢子形成停滞于分生孢子器原基阶段。Southern杂交证实T-DNA标记在ZS-1T2029中为单位点插入。证实T-DNA插入破坏了精氨酸特异性氨甲酰磷酸合成酶基因（CMCMPS1）,CMCPS1的cDNA全长为3900bp,编码含1170个氨基酸的蛋白。Southern杂交分析表明CMCPS1在盾壳霉ZS-1菌株中为单拷贝,Northern杂交显示在ZS-1T2029中没有检测到CMCPS1的mRNA,采用RNAi技术进一步证实CMCPS1与盾壳霉孢子形成相关。在PDA培养基中添加精氨酸或瓜氨酸可以恢复ZS-1T2029产孢试验表明T-DNA插入破坏CMCPS1导致不能合成精氨酸是ZS-1T2029不能产孢的原因。因此,精氨酸与盾壳霉分生孢子形成相关。在PDA培养基中添加一氧化氮供体硝普钠（SNP）可恢复ZS-1T2029产孢,而在PDA中添加一氧化氮合成酶（NOS）抑制剂L-硝基精氨酸甲酯（L-NAME）可以抑制ZS-1菌株产生分生孢子,试验结果表明精氨酸通过一氧化氮调控盾壳霉的分生孢子形成。进一步研究发现:一氧化氮在分生孢子器原基及分生孢子器中有大量的积累,而在菌丝中累积不明显;在PDB培养液中振荡培养,在ZS-1和ZS1-T2029中均可以产生NO,其释放量在第3d达到最高,但后者NO的产量显著下降。对产孢缺陷型突变体ZS-1T21882进行研究。ZS-1T21882在菌丝生长、寄生能力和分泌抗生物质等方面与出发菌株ZS-1相比没有显著差异。突变体与核盘菌菌落接触的地方及其菌核上均能够产生分生孢子,但在液体振荡培养时仅能形成分生孢子器原基。Southern杂交证实T-DNA标记在ZS-1T21882中为单拷贝插入。对ZS-1T21882中T-DNA插入破坏的基因进行了全长cDNA克隆,证实T-DNA插入破坏了谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶基因（CMAMPRS1）;CMAMPRS1的全长cDNA为1749 bp,含一个1560 bp的完整阅读框架（ORF）,该ORF编码含583个氨基酸的蛋白质。CMAMPRS1在盾壳霉基因组中为单拷贝,RT-PCR结果显示此基因在突变体ZS-1T21882中不表达,而在出发菌株ZS-1中有表达。谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶是生物体内从头合成次黄嘌呤中的第二个关键酶,研究发现在PDA培养基中添加次黄嘌呤可以恢复ZS-1T21882产孢,表明T-DNA插入破坏CMAMPRS1导致不能合成次黄嘌呤是ZS-1T21882不能产孢的原因。进一步研究发现,在PDA培养基中添加ATP、AMP和cAMP等均可以促使ZS-1T21882产孢,而添加GTP、GMP和cGMP等则不能恢复ZS-1T21882产孢。因此,推定盾壳霉孢子形成与腺嘌呤有关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.核盘菌重寄生真菌盾壳霉的研究进展
• 1.1 核盘菌及作物菌核病
• 1.2 盾壳霉的分类及分布和多样性
• 1.3 盾壳霉的生物学特性
• 1.4 盾壳霉与寄主的互作
• 1.5 盾壳霉的寄生生态学特性
• 1.6 盾壳霉控制作物菌核病应用及规模化生产
• 1.6.1 盾壳霉在作物菌核病防治中的应用
• 1.6.2 盾壳霉的规模化生产
• 1.7 盾壳霉的分子生物学研究
• 2 真菌孢子形成机理的研究
• 2.1 孢子形成与作物真菌病害
• 2.2 孢子形成与生防真菌的应用
• 2.3 环境对真菌孢子形成的影响
• 2.4 孢子形成的分子机理
• 3.真菌遗传转化研究进展
• 3.1 真菌遗传转化研究手段及特点
• 3.1.1 PEG介导的遗传转化
• 3.1.2 限制性内切酶介导的遗传转化
• 3.1.3.农杆菌介导的遗传转化
• 3.2 农杆菌介导转化的基本原理及其应用
• 3.2.1 农杆菌转化系统的发展
• 3.2.2 农杆菌介导转化的基本原理
• 3.2.3 农杆菌介导转化法（ATMT）在真菌转化中的应用
• 4 基因功能分析的策略
• 4.1 基因敲除策略在基因功能研究中的应用
• 4.2 RNAi技术在基因功能研究中的应用
• 5 本研究的立题依据和目的与意义
• 第二章 农杆菌介导高效转化盾壳霉及克隆相关基因技术平台的建立
• 1 材料
• 1.1 菌株及载体
• 1.2 抗生素
• 1.3 酶、试剂盒及其它试剂
• 1.4 其它试剂和培养基配制见附录1
• 1.5 DNA分子量标记
• 2 方法
• 2.1 农杆菌介导转化体系的优化
• 2.1.1 农杆菌介导的转化
• 2.1.2 用于转化的盾壳霉孢子最佳成熟度的筛选
• 2.1.3 用于转化的盾壳霉最佳孢子浓度的筛选
• 2.1.4 农杆菌菌液与盾壳霉孢子共培养时间对转化效率的影响
• 2.2 TAIL-PCR技术与相关基因的克隆
• 2.3 结合Southern杂交技术克隆相关基因
• 2.3.1 Southern杂交分析
• 2.3.2 反向PCR（Inverse-PCR）技术的应用
• 2.4 cDNA文库的建立与相关基因的克隆
• 2.4.1 盾壳霉ZS-1的培养
• 2.4.2 RNA的提取和纯化
• 2.4.3 cDNA文库的构建及文库质量的检测
• 2.4.4 文库cDNA第一链合成
• 2.4.5 文库cDNA第二链的合成及电泳检测
• 2.4.6 蛋白酶K的降解
• 2.4.7 Sfil酶的消化
• 2.4.8 合适cDNA片段的收集和电泳检测
• 2.4.9 cDNA的连接和噬菌体蛋白包装
• 2.4.10 滴度未扩增文库
• 2.4.10.1 大肠杆菌XL1-Blue株系的活化
• 2.4.10.2 未扩增文库的滴度检测
• 2.4.11 文库扩增
• 2.4.12 文库质量的检测
• 2.4.12.1 文库重组克隆百分比
• 2.4.12.2 扩增文库滴度检测
• 2.4.13 cDNA文库的应用
• 3 结果与分析
• 3.1 农杆菌介导转化体系的优化
• 3.1.1 用于转化的盾壳霉孢子最佳成熟度的筛选
• 3.1.2 用于转化的盾壳霉最佳孢子浓度的筛选
• 3.1.3 农杆菌菌液与盾壳霉孢子共培养时间对转化效率的影响
• 3.2 TAIL—PCR技术与相关基因的克隆
• 3.3 结合Southern杂交技术克隆相关基因
• 3.4 cDNA文库的建立与相关基因的克隆
• 3.4.1 盾壳霉ZS-1菌株总RNA的提取
• 3.4.2 文库质量的检测
• 3.4.3 cDNA文库的应用
• 4.结论与讨论
• 第三章 盾壳霉T-DNA插入体库的建立及部分产孢相关突变体的筛选及初步研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 培养基的配置
• 1.1.3 酶、载体、试剂盒及其它试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 T-DNA标记插入体库的构建
• 1.2.2 产孢缺陷型突变体的筛选
• 1.2.3 产孢缺陷型突变体生长速度测定
• 1.2.4 产孢缺陷型突变体寄生菌核致腐能力的比较
• 1.2.5 产孢缺陷型突变体产抗生物质（抗真菌物质和抗细菌物质）的测定
• 1.2.6 产孢缺陷型突变体T-DNA的插入拷贝数的分析
• 1.2.7 TAIL-PCR扩增产孢缺陷型突变体代表性菌株T-DNA侧端基因组DNA
• 2.结果与分析
• 2.1 产孢缺陷型突变体的筛选及分类
• 2.2 部分产孢缺陷型突变体的生长速度的测定结果
• 2.3 产孢缺陷型突变体寄生致腐菌核能力的比较
• 2.4 产孢缺陷型突变体产生抗生素的测定结果
• 2.5 部分产孢缺陷型突变体T-DNA的插入拷贝数的分析
• 2.6 部分产孢缺陷型突变体的TAIL—PCR扩增T-DNA标记两端基因组DNA序列及分析结果
• 3.结论与讨论
• 第四章:精氨酸通过一氧化氮调控盾壳霉分生孢子形成途径研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株及培养基
• 1.1.2 酶、试剂盒及其它试剂
• 1.1.3 引物
• 1.2 方法
• 1.2.1 ZS-1T2029的基本生物学特性研究
• 1.2.2 突变体ZS-1T2029及其ZS-1菌株菌落形成过程的观察
• 1.2.3 ZS-1T2029 T-DNA插入位点数分析
• 1.2.4 T-DNA侧端DNA序列的获得和序列分析
• 1.2.4.1 TAIL-PCR获得T-DNA侧端DNA序列
• 1.2.4.2 目的片段的回收及纯化
• 1.2.4.3 回收片段的连接与转化
• 1.2.4.4 重组质粒的鉴定和序列分析
• 1.2.5 CMCPS1全长cDNA的克隆
• 1.2.5.1 5'端序列的获得
• 1.2.5.2 3'端序列的获得
• 1.2.5.3 全长cDNA序列的拼接
• 1.2.6 CMCPS1基因拷贝数的验证
• 1.2.7 CMCPS1基因在出发菌株ZS-1中表达情况分析
• 1.2.8 精氨酸、瓜氨酸对突变体ZS-1T2029孢子形成的互补作用
• 1.2.9 CMCPS1基因功能的验证
• 1.2.9.1 RNAi特异性沉默CMCPS1载体的构建及转化
• 1.2.9.2 RNAi特异沉默CMCPS1转化子分析
• 1.2.10 多胺对突变体ZS-1T2029产孢的影响
• 1.2.11 一氧化氮供体硝普钠对突变体ZS-1T2029产孢的影响
• 1.2.12 一氧化氮合成酶抑制剂L-NAME对ZS-1菌株产孢的影响
• 1.2.13 ZS-1菌株和突变体ZS-1T2029中一氯化氮产量的检测
• 2.结果与分析
• 2.1 ZS-1T2029菌株的生物学特性
• 2.2 产孢缺陷型突变体ZS-1T2029及其ZS-1菌株孢子形成过程的比较
• 2.3 突变体ZS-1T2029中T-DNA为单位点插入
• 2.4 氨甲酰磷酸合成酶基因的获得和序列分析
• 2.5 TAIL-PCR扩增DNA的序列分析及T-DNA标记插入破坏CMCPS1基因位点预测
• 2.6 CMCPS1全长cDNA的获得
• 2.7 CMCPS1基因在盾壳霉ZS-1菌株中拷贝数及表达分析
• 2.8 精氨酸、瓜氨酸恢复产孢缺陷型突变体ZS-1T2029产孢
• 2.9 CMCPS1基因功能的验证
• 2.10 一氧化氮供体硝普钠对突变体ZS-1T2029产孢的影响
• 2.11 一氧化氮合成酶抑制剂L-NAME对ZS-1菌株产孢的影响
• 2.12 盾壳霉产生一氧化氮的检测
• 3 结论和讨论
• 3.1 结论
• 3.2 讨论
• 第五章:盾壳霉产孢相关基因磷酸核糖酰胺转移酶CMAMPRS1基因的克隆
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株及培养基
• 1.1.2 试剂、药品
• 1.1.3 引物
• 1.2 方法
• 1.2.1 ZS-1T21882的基本生物学特性研究
• 1.2.2 突变体ZS-1T21882及其ZS-1菌株孢子形成过程的观察
• 1.2.3 ZS-1T21882 T-DNA插入位点数分析
• 1.2.4 T-DNA侧端DNA序列的获得和序列分析
• 1.2.5 磷酸核糖酰胺转移酶（CMAMPRS1）基因全长cDNA的克隆
• 1.2.5.1 5'端序列的获得
• 1.2.5.2 3'端序列的获得
• 1.2.5.3 全长cDNA序列的拼接
• 1.2.6 CMAMPRS1基因拷贝数的验证
• 1.2.7 CMAMPRS1基因在出发菌株ZS-1中表达情况分析
• 1.2.8 次黄嘌呤（hypoxanthine,IMP）,AMP、GMP、cAMP对突变体ZS-1T21882孢子形成的互补作用
• 2.结果与分析
• 2.1 ZS-1T21882菌株的生物学特性
• 2.2 突变体ZS-1T21882及其ZS-1菌株孢子形成过程的观察
• 2.3 突变体ZS-1T21882中T-DNA为单位点插入
• 2.4 谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶基因的获得和序列分析
• 2.5 TAIL-PCR扩增DNA的序列分析及T-DNA标记插入破坏CMAMPRS1基因
• 2.6 CMAMPRS1基因在盾壳霉ZS-1菌株中拷贝数的分析
• 2.7 CMAMPRS1基因在盾壳霉ZS-1菌株的表达分析
• 2.8 次黄嘌呤（hyphxanthine,IMP）,AMP、GMP、cAMP对产孢缺陷型突变体ZS-1T21882孢子的恢复
• 3 结论和讨论
• 3.1 结论
• 3.2 讨论
• 第六章 其它几大类突变体的筛选及研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 培养基的配置
• 1.1.3 酶、载体、试剂盒及其它试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 产生抗真菌物质能力加强突变体的筛选
• 1.2.2 产生抗细菌物质能力丧失突变体的筛选
• 1.2.3 不寄生菌核的突变体
• 1.2.4 产色素变化突变体的筛选
• 1.2.5 高pH值敏感的突变体筛选
• 2.结果与分析
• 2.1 产生抗真菌物质能力加强突变体的筛选
• 2.2 产生抗细菌物质能力丧失突变体的筛选
• 2.3 不寄生菌核的突变体的筛选
• 2.4 产色素变化突变体的筛选
• 2.5 高pH值敏感的突变体筛选
• 3.结论与讨论
• 3.1 结论
• 3.2 讨论
• 结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录1 各种溶液、培养基、试剂及所用药品的配方
• 附录2 产孢缺陷型突变体的筛选结果及分类
• 附录3 已发表的相关文章