不同葡萄CBF1基因序列差异性分析及植物表达载体构建

论文摘要

植物在经受低温胁迫后会发生不同程度的伤害,严重时甚至导致整个植株死亡。近年来在模式植物拟南芥中发现的CBFs（CRT/DRE binding factors）低温反应途径,使当前果树抗寒分子生物学与基因工程研究取得了重大突破。CBFs（C-repeat binding factors）基因能够与COR基因启动子区域的CRT/DRE（C- repeat/dehydration responsive element）顺式作用元件识别并特异结合,诱导COR基因表达,从而提高植物的抗寒能力。CBFs基因能够综合改良植物的抗逆性状,已成为植物抗寒分子育种的研究热点。本研究对山葡萄、贝达、Ln33、SO4、黑比诺的低温诱导转录因子CBFl基因进行了克隆与序列差异性分析;构建了山葡萄转录因子CBFl基因的植物表达载体,为下一步建立葡萄高效遗传转化体系奠定实验基础。本实验主要研究结果如下:⑴根据欧洲葡萄CBF1基因序列设计1对特异引物,采用PCR方法从山葡萄、贝达、Ln33、SO4、黑比诺基因组中各扩增出1个DNA片段并克隆到pMD18-T载体中。经序列测定和分析,各片段均长756bp,与欧洲葡萄CBF1基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列分别具有98.28～99.21%和98.39～98.8%的同源性,而且推导的氨基酸序列中包含有同源性更高的AP2/EREBP DNA结合域以及CBFs蛋白的两段特征序列（PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR）。结果表明,从五种葡萄中均可以克隆出CBF1基因。⑵对五种葡萄CBFl蛋白进行一级结构分析,CBFl蛋白的分子式为C1191～1202H1899～1908N347～350O378～380S12,相对分子质量为27.57～27.69kD,理论等电点为6.97～8.41,脂肪系数平均为65.74～66.14,亲水性平均数为-0.576～-0.564,不稳定系数为48.34～52.22,均为不稳定蛋白;又对五种CBFl蛋白进行了亲/疏水性、信号肽、跨膜结构分析,均为亲水性、非分泌蛋白,无信号肽及跨膜结构域存在。结果表明,五种葡萄的CBF1基因无明显差异存在。⑶利用CaMV 35S启动子构建了山葡萄转录因子CBFl基因的植物表达载体。用限制性内切酶BamHI和SacI双酶切pMD18-CBF1和pBI121两种质粒DNA,分别回收CBF1基因片段和除去了GUS基因的pBI121表达载体,将pBI121表达载体与CBF1基因连接,转化E.coli DH5α感受态细胞,并对重组质粒进行PCR、BamHI和SacI双酶切鉴定。结果表明,成功构建了CBF1基因植物表达载体pBI-CBF1。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1 引言
• 2 植物抗寒分子机理研究进展
• 2.1 抗冻蛋白基因
• 2.1.1 昆虫抗冻蛋白基因
• 2.1.2 植物抗冻蛋白基因
• 2.2 与膜结构及其稳定性相关的基因
• 2.2.1 甘油三磷脂酰转移酶
• 2.2.2 脂肪酸去饱和酶
• 2.3 与活性氧清除相关的基因
• 2.3.1 超氧化物歧化酶
• 2.3.2 过氧化氢酶
• 2.3.3 抗坏血酸过氧化物酶
• 2.3.4 谷胱甘肽还原酶
• 2.4 胚胎发育晚期富集蛋白基因
• 3 CBFS 转录因子研究进展
• 3.1 CBFs 的鉴定
• 3.2 CBFs 基因的结构与特性
• 3.3 CBFs 基因的调控因子
• 3.3.1 正调控因子
• 3.3.2 负调控因子
• 3.4 CBFs 基因调控的下游基因
• 3.5 CBFs 基因调控的生理生化功能
• 3.6 CBFs 基因在抗逆条件下的交叉适应现象
• 4 植物基因工程常用启动子研究进展
• 4.1 启动子的概念
• 4.2 启动子的结构特征
• 4.2.1 TATA 盒
• 4.2.2 转录起始点
• 4.2.3 CAAT 盒
• 4.2.4 GC 盒
• 4.3 启动子的类型
• 4.3.1 组成型启动子
• 4.3.2 诱导型启动子
• 4.3.3 组织或器官特异型启动子
• 5 本研究的目的和意义
• 1基因片段的克隆及序列分析'>第二章 不同葡萄CBF₁基因片段的克隆及序列分析
• 1 技术路线
• 2 材料与试剂
• 2.1 植物材料
• 2.2 载体及菌株
• 2.3 实验药品
• 2.4 实验仪器与设备
• 2.5 主要试剂溶液及培养基的配制
• 3 实验方法
• 3.1 五种葡萄基因组DNA 的提取及浓度检测
• 3.1.1 五种葡萄基因组DNA 的提取
• 3.1.2 检测DNA 的质量与纯度
• 3.2 目的片段的PCR 扩增
• 3.2.1 引物设计与合成
• 3.2.2 目的片段的PCR 扩增
• 3.3 PCR 产物的回收
• 3.4 目的片段与pMD18-T 载体连接
• 3.5 E.coli DH5α感受态细胞的制备
• 3.6 连接产物的转化
• 3.7 重组质粒的鉴定
• 3.7.1 蓝白斑筛选
• 3.7.2 碱裂解法小量提取质粒DNA
• 3.7.3 重组质粒PCR 鉴定
• 3.7.4 重组质粒的双酶切鉴定
• 3.8 序列测定及生物信息学分析
• 4 结果与分析
• 4.1 葡萄基因组DNA 质量分析
• 1 基因的PCR 扩增'>4.2 CBF₁ 基因的PCR 扩增
• 1 基因阳性克隆鉴定'>4.3 CBF₁基因阳性克隆鉴定
• 1 基因序列的生物信息学分析'>4.4 CBF₁基因序列的生物信息学分析
• 1 基因的核苷酸序列分析'>4.4.1 CBF₁基因的核苷酸序列分析
• 1 基因的氨基酸序列分析'>4.4.2 CBF₁基因的氨基酸序列分析
• 1 一级结构及理化性质分析'>4.4.3 CBF₁一级结构及理化性质分析
• 4.4.4 氨基酸序列疏水性/亲水性预测和分析
• 4.4.5 氨基酸序列信号肽的预测和分析
• 4.4.6 氨基酸序列跨膜结构域分析
• 5 讨论
• 5.1 葡萄基因组DNA 的提取
• 5.2 PCR 引物的设计
• 5.3 PCR 反应体系的优化
• 5.4 测序
• 第三章 植物表达载体构建
• 1 技术路线
• 2 材料与试剂
• 2.1 质粒与菌株
• 2.2 实验药品
• 2.3 实验仪器与设备
• 2.4 主要试剂溶液及培养基的配制
• 3 实验方法
• 3.1 目的基因的制备
• 3.1.1 摇菌
• 3.1.2 质粒DNA 的提取
• 1 片段的PCR 扩增'>3.1.3 CBF₁ 片段的PCR 扩增
• 3.1.4 目的片段的回收
• 1 双酶切'>3.1.5 质粒pMD18-CBF₁双酶切
• 3.2 载体的制备
• 3.2.1 摇菌
• 3.2.2 质粒DNA 的提取
• 3.2.3 质粒pBI121 双酶切
• 3.3 目的基因与载体的连接
• 3.4 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞
• 3.5 重组质粒的鉴定
• 3.5.1 重组质粒的PCR 鉴定
• 3.5.2 重组质粒双酶切鉴定
• 4 结果与分析
• 4.1 目的基因和载体的准备
• 4.2 重组质粒的鉴定
• 5 讨论
• 5.1 PCR 引物中引入酶切位点
• 5.2 植物表达载体的选择
• 5.3 DNA 连接酶的选择
• 5.4 双酶切反应
• 5.5 连接反应
• 第四章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 导师简介
• 作者简介