论文摘要
天然葡激酶（staphylokinase，SAK）是溶原性金黄色葡萄球菌合成的一种单链蛋白，由136个氨基酸组成，其中包括45个带电氨基酸残基不含半胱氨酸及二硫键，分子量15.5kDa。研究发现SAK可以选择性的作用于纤维蛋白原。SAK具有纤维蛋白特异性高，对血小板富集型血栓作用强等优点。与同期上市的溶栓药物相比具有溶栓效果好，专一性强，副作用小，价格便宜等优点。我室研制的重组葡激酶（rSAK）已经完成二期临床实验，对急性心梗的治疗结果表明，rSAK的再通率显著高于r-tPA，显示出良好的临床应用前景。但是SAK作为一种细菌源性蛋白，在用药后两周产生大量中和性抗体，影响其重复使用。在一定程度上限制了其临床应用范围。对SAK分子进行修饰，改造其抗原表位，是获得新型低免疫原性溶栓药物的重要方法之一。本研究利用Biosun软件，对我室的野生型SAK（wild type staphylokinase，wtSAK）的抗原表位进行了预测，并结合SAK晶体结构和对其抗原表位研究的报道，选择了多个位点的氨基酸进行了缺失和突变，构建了10个SAK的突变体。结合SAK突变体活性和表达情况对其进行了筛选。从中选择了突变体SAK2进行了表达和纯化工艺的研究，进一步对其活性和免疫原性进行了分析和评价。主要研究内容和实验结果如下：1．SAK系列突变体的构建，表达，纯化及活性分析利用重叠延伸PCR方法，构建了N端缺失及特定位点突变的系列SAK突变体（SAK1—SAK10）。将编码突变体基因的DNA片段重组入表达载体pBV220，转化E.coliBL21感受态细胞进行诱导表达。结果显示，SAK1—SAK10在E.coli/pBV220受体菌中均以包涵体形式表达。选择突变位点较多的SAK1，SAK2，SAK7及SAK8重组入pET17b载体中，转化E.coliBL21感受态细胞，诱导表达后以可溶性形式表达。活性检测结果显示突变体SAK2的溶栓活性与wtSAK相当，而其余突变体的活性与野生型SAK（wtSAK）相比均有所下降。2．SAK2大规模制备工艺的研究，多克隆抗体制备及抗原抗体反应性比较将E.coliBL21/pET17b-SAK2菌株进行发酵，大量表达后，进行纯化。经过阴离子交换层析和凝胶过滤层析两步纯化，SAK2纯度达95％以上。使用纤维蛋白平板溶圈法检测SAK2活性，其活性达到（3.5±1.4）×104AU/mg，与野生型SAK活性（4.1±0.8）×104AU/mg相当。经过两次加强免疫，制备wtSAK和SAK2的兔源多抗，抗血清的滴度达到1×107时取血。用ELISA检测抗原抗体的反应性；使用纤维蛋白平板溶圈法检测兔抗wtSAK抗血清分别与wtSAK和SAK2结合后的蛋白溶栓活性。实验结果证明SAK2与兔抗wtSAK抗体的反应性显著下降，与兔抗wtSAK结合后的溶栓活性下降程度显著低于wtSAK，说明wtSAK中的部分抗原表位已被缺失。使用饱和硫酸胺沉淀法粗提兔抗wtSAK和兔抗SAK2，再用DEAE柱阴离子交换纯化IgG抗体，得到兔抗wtSAK和兔抗SAK2多克隆抗体。经ELISA法检测抗体滴度为1×105。3．wtSAK和SAK2在猕猴体内产生抗体的比较以猕猴作为实验动物，选择小剂量多次给药的给药方案：使用0.02mg/kg体重剂量；隔天给药；给药七次持续两周。停止给药后十周再次给药，给药方案与第一次相同，给药结束后观察十一周。整个过程中选择15个时间点采血，使用ELISA方法检测猕猴血清中抗体水平。选择抗体水平最高的时间点检测血清的中和活性。对wtSAK组和SAK2组的抗体水平检测结果说明两组整体的抗体变化趋势基本一致，均在第二轮给药期出现抗体水平的明显升高，但SAK2组抗体水平显著低于wtSAK组。wtSAK组在第一轮给药中出现了抗体水平的小幅升高，而SAK2组抗体水平在第一轮给药期无明显变化。wtSAK和SAK2分别和各自的猕猴抗血清温育结合后，wtSAK的溶栓活性仅保持了3.8％，而SAK2的残余溶栓活性为75.3％。以上结果说明在小剂量反复给药方案下SAK2的效果优于wtSAK。在给药期和观察期共6个月的时间内SAK2的活性受其抗体影响较小。4．小剂量反复用药方案对机体血纤溶系统和凝血系统的影响在反复多次给药的6个月观察期内，选择反映血凝的指标PT，APTT，TT，和反映纤维蛋白溶解系统的指标FIB，PLG，α2-PI进行检测。结果显示以上各指标在用药过程中均无显著变化。综上所述，我们设计构建了SAK的系列突变体；筛选并获得了活性较高，抗原性降低，可溶性表达的突变体SAK2；建立了发酵培养和纯化制备工艺；阐明了其在灵长类动物体内的抗体动态变化规律；评价了该突变体反复多次给药对血纤溶系统和凝血系统的影响。为下一步将其研制成能够反复多次使用的溶栓新药物奠定了基础。
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相关论文文献
- [1].重组葡激酶和水蛭素融合蛋白的血栓靶向性机制(英文)[J]. 生物工程学报 2008(11)
- [2].重组葡激酶的表达纯化及纤溶活性鉴定[J]. 重庆医科大学学报 2012(03)