微流控芯片Edman降解及在蛋白质测序中的应用研究

论文摘要

蛋白质的一级结构,即蛋白质内氨基酸的排列顺序是蛋白质科学研究的前提,获得该信息是一直是生命科学最重要研究内容之一,具有相当重要的意义。然而当前蛋白质序列测定的质谱法和Edman降解法都存在着不足之处。前者的局限在于准确度不高,会产生错误、假阳性的结果;后者灵敏度过低,需要样品量多,难于应用于同疾病相关的低丰度蛋白质序列测定。本文首次研究在微流控芯片内完成Edman降解,大幅度提高了Edman降解法测序的灵敏度,并且通过同MS技术联用,提高痕量蛋白质序列鉴定的准确度。第一章综述了蛋白质一级序列测定进展。第二章研制了体积仅为3.5 nL、可以重复使用的微流控芯片C18固相微萃取装置,研究了在微流控芯片上精确控制纳升级流体的方法。该C18柱可以富集痕量的多肽样品。二维凝胶电泳分离后的蛋白质酶解液通过固相微萃取脱盐后,样品体积由几微升浓缩到50 nL并直接转移至MALDI-TOF-MS靶上进行测定。分析结果表明新的方法能够大幅度蛋白质测定的序列覆盖度。第三章研究了在微流控芯片用Edman降解测定蛋白质序列的方法和性能,并通过分子量的差别鉴定多肽的序列。采用该方法测定了亚飞摩尔级别合成多肽的序列,比经典的Edman降解法的样品用量降低了数百倍。与MALDI-TOF-MS相结合测定二维凝胶电泳分离后银染蛋白质样品序列时,原先模棱两可的结果有了明确的归属。第四章通过在微流控芯片上进行一个循环的Edman降解,准确地得到多肽N端氨基酸残基的信息,解决了MS/MS谱图内难以辨别b/y系列离子的难题,并成功地完成了三个多肽样品（包括一个C端修饰的神经多肽）的从头测序。通过两个循环的Edman降解能够得到多肽的N端两个氨基酸残基的序列,根据这些信息能够推断出原始多肽MS/MS谱图中b2离子的摩尔质量。采用b2离子作为内标,可以提高测定MS/MS谱图中其它碎片质荷比的准确度,从而解决了在MS/MS测定时难以用内标法提高测定碎片离子摩尔质量准确度的问题。第五章旨在提高Edman测序的自动化程度。研究了用注射泵输送气体试剂进行气相Edman降解的方法,用毛细管力将纳升级的液体试剂吸入微流控芯片,并用氮气压力将纳升级的液体试剂定量传输到固定了多肽样品的C18反应柱,实现了飞摩尔级Edman测序操作的初步自动化。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1.引言
• 1.2.Edman降解法
• 1.2.1.Edman降解方法学
• 1.2.2.Edman测序法应用研究
• 1.2.3.Edman降解—质谱联用技术应用于蛋白质的序列分析
• 1.3.生物质谱蛋白质序列测定法
• 1.3.1.肽指纹图谱法（Peptide Mass Fingerprints,PMF）
• 1.3.2.串联质谱（Tandem Ms）测序技术
• 1.3.3.MS/MS法的缺点
• 1.3.4.用化学修饰法提高质谱法鉴定的准确度
• 1.4.其他蛋白质测序方法
• 1.4.1.二硝基氟苯（DNFB）法
• 1.4.2.酶学测序法
• 1.5.微流控芯片反应器技术研究
• 1.6.小结
• 参考文献
• 第二章 纳升级芯片固相萃取系统
• 2.1.引言
• 2.2.实验部分
• 2.2.1.试剂及材料
• 2.2.2.固相微萃取芯片的制作
• 2.2.3.微固相萃取系统的组成
• 2.2.4.C18柱的填充及更换
• 2.2.5.酶解及萃取条件
• 2.2.6.普通质谱制样方法
• 2.2.7.样品的固相微萃取步骤
• 2.2.8.质谱检测
• 2.3.结果与讨论
• 2.3.1.围堰的制备及流体的控制
• 2.3.2.纳升级流体的控制
• 2.3.3.微固相萃取柱的优化
• 2.3.4.微固相萃取柱的灵敏度
• 2.3.5.填充材料的选择
• 2.3.6.银染2-DE胶上实际样品的分析
• 2.4.结论
• 参考文献
• 第三章 基于微流控芯片的Edman降解法
• 3.1.前言
• 3.2.实验部分
• 3.2.1.试剂及材料
• 3.2.2.微流控芯片Edman降解系统
• 3.2.3.外界和芯片的接口（"World to chip"interface）
• 3.2.4.TMA与TFA的气体的传输
• 3.2.5.Edman降解反应步骤
• 3.2.6.质谱测试
• 3.2.7.序列测定方法
• 3.3.结果与讨论
• 3.3.1.切割方法对灵敏度的影响
• 3.3.2.微流控芯片Edman降解法的灵敏度
• 3.3.3.实际样品的分析
• 3.4.结论
• 参考文献
• 第四章 芯片Edman降解在从头测序法中的应用研究
• 4.1.前言
• 4.2.实验部分
• 4.2.1.试剂及材料
• 4.2.2.Edman降解
• 4.2.3.质谱测试
• 4.3.结果与讨论
• 4.3.1.不同系列离子的辨别方法
• 4.3.2.合成多肽的测试
• 4.3.3.C端修饰神经多肽的测试
• 2离子作为内标提高质量测定精度研究'>4.3.4.利用b₂离子作为内标提高质量测定精度研究
• 4.4.结论
• 参考文献
• 第五章 微流控芯片蛋白质测序仪的初步研究
• 5.1.前言
• 5.2.实验部分
• 5.2.1.试剂
• 5.2.2.芯片设计与制作
• 5.2.3.反应柱填充及更换
• 5.2.4.样品的加载
• 5.2.5.实验装置及组装
• 5.2.6.降解流程
• 5.2.7.洗脱
• 5.2.8.质谱测试
• 5.3.结果与讨论
• 5.3.1.SIA系统流路及芯片的设计
• 5.3.2.样品加载
• 5.3.3.降解程序的设计
• 5.3.4."Chip to MALDI"接口
• 5.3.5.样品的分析与测试
• 5.4.结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢