论文摘要
研究背景和目的原发性肝癌（Primary hepatic carcinoma,PHC）是世界上常见的恶性肿瘤之一,在全球范围内发病率排第五,死亡率排第三。在中国广西,肝癌的死亡率则占全部恶性肿瘤死亡率的第一位,严重危害着人们的健康。黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）和乙型肝炎病毒（HBV）被公认为与肝癌发生密切相关的二大因素,其中AFB1已被世界卫生组织确定为人类第一类已知致癌物。AFB1在没有经过代谢活化之前的母体化合物是无致癌性的,它必须通过体内的生物转化形成活性中间体AFB1-exo-8,9-环氧化物（AFBO）才具有致癌性。γ-谷氨酰转肽酶阳性肝细胞灶（γ-GT灶）、AFP、AFB1-DNA加合物、血清AFB1-白蛋白加合物及8-羟基脱氧鸟嘌呤核苷（8-hydroxydeoxyguanosine,8-OHdG）等被证实为与肝癌的发生密切相关的生物标记物。肿瘤的化学预防被定义为用化学的方法抑制、延迟或逆转癌变过程,并防止癌的发生发展。AFB1污染的高危地区多在发展中国家。由于这些地区经济的不发达,粮食的保管及防霉去毒措施不健全,食品难免受到AFB1不同程度的污染。因此,在这些地区寻找能对抗AFB1诱导肝癌形成的天然物或其提取物,对肝癌的防治有重要意义的。银杏树是世界上最古老的植物之一,被称为植物“活化石”。标准的银杏叶提取物（Ginkgo Biloba Extract）被国际通称为EGb761,一般含有24%的黄酮苷类及5%～7%的银杏中独一无二的萜烯类。目前,银杏药用价值已从最初的在心脑血管系统疾病的应用扩展至更广泛的领域。近来研究发现EGb761及其组分由于其抗氧化、抗血管生成及其基因调节而具有抗癌的作用。但迄今尚未见到关于EGb761抑制AFB1致肝癌方面的报道。本文旨在探讨EGb761在AFB1诱发大鼠肝癌过程中的作用及其机制。方法71只雄性Wistar大鼠适应环境后随机分为3组:（1）AFB1组28只饲正常饲料,腹腔注射AFB1至第46W;（2）EGb761组29只饲含2g/Kg的EGb761饲料,腹腔注射AFB1,时间及剂量同AFB1组;（3）对照组14只饲正常饲料,不给予AFB1。实验至64W结束。分别于实验第14W、28W、42W、55W对全部动物进行抽血和肝活检,第64W处死全部动物。血清标本于-40℃保存,用ELISA法检测血清AFP;用HPLC法检测血清AFB1-赖氨酸加合物。肝组织标本分成3块,一块冷冻保存于-80℃,用于RT-PCR检测C-myc和Cyclin D1 mRNA的表达水平及用FCM检测第64W各组动物肝的细胞周期及细胞凋亡;一块立即予预冷的生理盐水洗去血液,并在冰上操作制备肝匀浆,分离出肝微粒体,应用分光光度法检测肝药酶（Ⅰ相酶CYP450;Ⅱ相酶GST;抗氧化物酶GSH-Px、SOD及脂质过氧化产物MDA）;一块立即放入预冷的95%酒精:丙酮（V∶V=1∶1）内固定,24h后低温石蜡包埋,用于γ-GT特殊染色或放入10%中性福尔马林溶液内固定24h后常规石蜡包埋,用于HE染色及免疫组织化学染色,检测C-myc、Cyclin D1、Survivin、Bcl-2、Bax及8-OHdG蛋白的表达,并对各蛋白表达的相关性进行分析。结果1.大鼠肿瘤发生情况:实验结束（第64W）时,AFB1组有效动物数为25只,发生恶性肿瘤20例（80%）,其中纤维肉瘤1例、胆管细胞癌2例,其余为肝细胞肝癌（HCC）;PHC发生率为76%（19/25）。EGb761组为26只,发生恶性肿瘤8例（30.76%）,其中肾癌1例、胆管细胞癌2例,其余为HCC;PHC发生率为26.92%（7/26）。对照组12只,无肿瘤发生。AFB1诱发大鼠肝恶性肿瘤（纤维肉瘤）形成的最早时间在第46W,第一例肝癌的发生在第51W,均为AFB1组大鼠。活检肝组织镜下动态观察显示AFB1诱发大鼠肝癌的癌变过程可以分为三个阶段,第一阶段（14W～28W）,肝细胞出现不同程度的变性;第二阶段（29W～54W）出现各种异常肝细胞增生灶及增生结节,主要为嗜碱性结节;第三阶段（55W～64W）上述病变进一步加重,可见癌结节。EGb761组大鼠诱癌各时期肝脏损害均较AFB1组轻,增生性病变发生亦较迟,大鼠平均生存时间及最终肝癌发生率亦显著低于AFB1组。对照组无上述改变。2.EGb761对大鼠肝脏γ-GT灶的影响实验第42W和55W,无论是γ-GT阳性灶单个灶的面积（mm2/focus）还是总面积（mm2/cm2）,EGb761组分别为4.65±0.16、0.97+0.03和9.03±0.35、1.62±0.06,均显著小于AFB1组7.95±0.30、2.54±0.05和17.87±0.71、4.68±0.12（all P=0.000）。第42W,EGb761组γ-GT阳性灶的个数（numbers/cm2）为0.21±0.006亦明显少于AFB1组0.35±0.006（P=0.004）。正常对照组未发现γ-GT灶。3.EGb761对大鼠血清AFP的影响由实验第28W至64W,血清AFP（ng/mL）在三个实验组均显示明显增高的趋势（P＜0.05）,但以AFB1组增高的较显著。第42W和第64W,EGb761组血清AFP分别为131.15±4.85和349.49±5.73,明显低于AFB1组的242.75±5.93和421.66±6.79（P＜0.05）;正常对照组为121.35±6.70和245.34±12.61亦低于AFB1组（P＜0.05）。4.EGb761对大鼠血清AFB1-赖氨酸加合物的影响血清AFB1-赖氨酸加合物（pg/mg Albumin）的最高水平发生于实验的第14周AFB1组,最大值为4356.01。EGB761在实验第14W、42W和64W显著抑制了血清AFB1-赖氨酸加合物的形成,抑制率分别为13.07%（P=0.033）、73.63%（P=0.002）和100%（P=0.038）。5.EGb761对肝药酶的影响5.1 EGb761对Ⅰ相代谢酶CYP450的影响在实验的第14W、28W、42W及64W,EGb761组CYP450的含量（nmoL/mgprot）分别为0.21±0.01、0.37±0.01、0.45±0.01、0.34±0.01,较AFB1组的0.21±0.01、0.40±0.01、0.45±0.01、0.45±0.01有下降趋势,但未显示统计学差异(（P=0.085）。对照组CYP450含量分别为0.22±0.01、0.34±0.03、0.21±0.02、0.30±0.02,在实验过程中变化不明显（P=0.085）。5.2 EGb761对Ⅱ相代谢酶GST活力的影响在实验第14W及28W时,AFB1组GST活力（U/mgprot）分别为31.50±0.81、44.13±0.90,明显高于EGb761组的13.33±0.29、29.62±0.52和正常对照组的18.03±0.74、24.36±1.10（P＜0.01）;第42W,三组GST活力持平,分别为21.52±0.40、22.79±0.31、26.68±0.59（P=0.173）;至第64W,EGb761组GST有所增高,为19.67±0.40,AFB1组及对照组为16.91±0.41、22.62±0.87,但未显示出统计学意义（P=0.211）。5.3 EGb761对GSH-Px活力的影响AFB1组在实验第14W及28W时,GSH-Px活力（unit of activity）分别为28.13±0.75、70.76±1.36,明显高于EGb761组的14.28±0.28、45.25±0.90和对照组的17.77±0.79、22.06±0.89（P＜0.01）;第42W时,EGb761组增高至47.23±0.74,AFB1组降低至49.10±0.82,差异无统计学意义（P=0.698）,但均高于对照组34.11±0.87（P＜0.05）;第64W时,EGb761组为39.71±0.84显著高于AFB1组的27.28±0.46（P=0.008）,但未明显高于对照组30.23±1.02（P=0.078）。5.4 EGb761对SOD活力的影响在实验第14W及28W时,AFB1组SOD活力（U/mgprot）分别为43.85±1.06、36.25±0.69,明显高于EGb761组21.98±0.42、22.93±0.42和对照组的28.67±1.05、24.71±0.95（P＜0.05）;至第42W和64W时,EGb761组分别为43.41±0.82、42.28±0.66,显著高于AFB1组的31.67±0.76、19.46±0.35（P＜0.05）,但未明显高于对照组34.57±0.98、35.09±0.68（P＞0.05）。5.5 EGb761对MDA形成的影响EGb761组在实验第14W、28W、42W及64W时,大鼠肝组织MDA含量（nmoL/mgprot）分别为0.14±0.01、0.24±0.01、0.36±0.01、0.60±0.01,均显著低于AFB1组的0.27±0.01、0.66±0.01、0.56±0.01、0.93±0.02（P＜0.05）,在第64W时还明显低于对照组的0.84±0.03（P=0.044）。6.EGb761对大鼠肝组织8-OHdG蛋白表达的影响EGb761组在第28W、42W和64W时,免疫组织化学结果显示8-OHdG蛋白的表达强度均显著低于AFB1组（P＜0.05）,在这三个时段,正常对照组亦显著低于AFB1组（P＜0.05）。7.EGb761对大鼠肝细胞周期及周期相关因子的影响7.1 EGb761对大鼠肝细胞周期的影响EGb761组大鼠G0/G1期（9/6）比率为79.44±3.11,S期细胞比率为14.70±3.04,与AFB1组的67.08±2.32、22.90±4.62相比,差异显著（P＜0.05）,但仍未恢复至正常对照组的水平:90.02±1.53、5.70±1.86（P＜0.05）。7.2 EGb761对大鼠肝组织Cyclin D1表达的影响Cyclin D1 mRNA在第28W和第64W肝组织中的表达强度,EGb761组分别为0.76±0.22、1.99±0.99,显著低于AFB1组的2.07±1.24、3.64±2.74（P＜0.05）,与对照组的0.79±0.27、0.99±0.49比较,无显著差异（P＞0.05）。第42W,三组Cyclin D1 mRNA的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。免疫组织化学结果显示:诱癌过程中Cyclin D1蛋白表达逐渐上升,尤其在AFB1组最明显。实验第28W、42W、64W,EGb761组Cyclin D1蛋白的表达均明显低于AFB1组（P＜0.05）,而与对照组无显著差异（P＞0.05）。7.3 EGb761对大鼠肝组织C-myc表达的影响C-myc mRNA在第28W和第64W肝组织中的表达强度,EGb761组分别为0.12±0.08、0.41±0.20,显著低于AFB1组的0.24±0.15、0.64±0.57（P＜0.05）,而与对照组无差异0.05±0.02、0.05±0.03（P＞0.05）。第42W,AFB1组和EGb761组无差异,分别为0.35±0.17、0.30±0.17（P＞0.05）,但均显著高于对照组的0.03±0.02（P＜0.05）。在实验第28W、42W、64W,免疫组织化学结果表明EGb761组C-myc蛋白的表达均明显低于AFB1组（P＜0.05）,而与对照组无差异（P＞0.05）。8 EGb761对大鼠肝细胞凋亡及凋亡相关因子的影响8.1 EGb761对大鼠肝细胞凋亡率的影响EGb761组大鼠肝细胞的凋亡率（%）为9.26±2.78,明显高于AFB1组0.36±0.15和对照组1.44±0.58（P＜0.05）。8.2 EGb761对大鼠肝组织Survivin蛋白表达的影响实验第28W、42W、64W,免疫组织化学结果表明:EGb761组Survivin蛋白的表达均明显低于AFB1组（P＜0.05）,与对照组无差异（P＞0.05）。8.3 EGb761对大鼠肝Bcl-2/Bax蛋白表达的影响只在实验第42W,EGb761组Bcl-2蛋白的表达低于AFB1组（p=0.000）;第28W和64W,AFB1组Bcl-2蛋白的表达明显高于对照组（P＜0.05）,但与EGb761组无显著差异（P＞0.05）。实验第42W和64W,EGb761组Bax蛋白的表达显著高于AFB1组（P＜0.05）,并且对照组Bax蛋白的表达亦高于AFB1组（P＜0.05）。第28W,三组Bax蛋白的表达无明显差异（P＞0.05）。结论1.EGb761能够抑制癌前标志物γ-GT阳性灶和AFB1-赖氨酸加合物的形成,降低MDA和8-OHdG的形成,增强GSH-Px和SOD活力,减轻自由基所致的脂质过氧化损伤,提高机体的抗氧化能力,最终抑制或延缓AFB1诱发的肝癌发生、发展的进程。2.EGb761在转录水平及蛋白水平均降低细胞周期相关因子Cyclin D1和C-myc的表达,延缓细胞的生长,从而阻止细胞分裂和恶性增殖可能是其抗癌作用机理之一。3.EGb761在AFB1诱癌过程中,明显减少Survivin的表达,诱导Bcl-2的下调,Bax上调,提示EGb761通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥抗癌作用。4.EGb761具有抗癌作用,有可能成为人类与AFB1相关性肝癌的化学预防剂。目的研究银杏叶提取物（EGb761）对人肝癌细胞株HepG2细胞周期和细胞凋亡的影响及其机理。方法以MTT法观察EGb761对HepG2细胞的生长抑制率,计算出IC50值用于后续的实验。通过HE染色及克隆形成等实验,观察EGb761对HepG2细胞生物学功能的影响,应用吖啶橙荧光染色、电镜观察及FCM检测EGb761作用前后对HepG2细胞凋亡的影响,再应用RT-PCR及免疫细胞化学检测周期及凋亡相关因子在转录及蛋白水平的表达。结果1.EGb761在55μg/mL、109μg/mL、219μg/mL、438μg/mL、875μg/mL的浓度范围内对HepG2细胞生长呈剂量依赖性的抑制作用,24h的IC50为438μg/mL。EGb761处理后HepG2细胞生长状态较差,且细胞克隆形成数目明显下降,与未用EGb761处理的对照组比较分别为40±4.34和102.67±4.51（P=0.000,并且EGb761组克隆直径也小于对照组）。2.438μg/mL EGb761处理HepG2细胞24h,吖啶橙荧光染色可见细胞核浓缩成圆形的黄绿色荧光染色;电镜发现特征性的凋亡小体的改变。FCM显示在12h、24h、48h时间点凋亡率明显高于对照组,分别为10.09%和0.48%、11.40%和1.07%、13.87%和0.67%。但是EGb761对细胞周期无明显影响。3.EGb761明显降低了C-myc mRNA的表达（P＜0.05）,但C-myc蛋白在EGb761作用前后均无表达;EGb761对Cyclin D1 mRNA及Cyclin D1蛋白的表达均无明显影响;而EGb761作用后Bcl-2蛋白的表达降低,Bax蛋白的表达水平明显升高（P＜0.01）。结论EGb761对体外培养的肝癌细胞株HepG2的生长繁殖具有抑制作用,其可能通过诱导HepG2细胞凋亡发挥其抗肿瘤作用,Bcl-2/Bax通路参与了这个过程。
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