文心兰花发育相关基因的cDNA-AFLP差异显示及表达分析

论文摘要

植物开花过程是高等植物生活史中非常重要的一环,受环境信号和植物体内部信号的共同调节。对植物花发育相关生理和分子生物学进行研究已是近20多年来植物生理学和植物生物学的热点研究领域。研究发现,植物开花过程可分为三个阶段:开花决定、花的发端、花器官形成和发育。LFY （LEAFY）基因在花发育的三个阶段都起着重要的调节作用,它处于花发育相关基因调控网络的中心位置。蔗糖被发现能够通过影响LFY基因的激活而促进或延后开花。cDNA限制性片段长度多态性（cDNA-AFLP）技术是一种高通量、基因组规模的转录组分析技术。本研究通过一系列实验建立了稳定的cDNA-AFLP实验体系,发现利用TRIzol法提取总RNA,利用EcoRⅠ和MseⅠ将cDNA酶切3 h,预扩增产物稀释15倍作为选择性扩增模板,可以获得重复性较好的cDNA-AFLP指纹图谱。通过引物筛选获得了114对适合于文心兰cDNA-AFLP分析的选择性扩增引物。依据建立的cDNA-AFLP分析体系,对文心兰Oncidium‘Milliongolds’花芽发育过程中的差异表达基因进行了分析。利用114对引物,总共获得了约15960条TDFs。对其中1248条进行回收、克隆和测序,得到了993条可读序列。BLASTX/N同源性比对分析所有获得的序列,发现80%以上的TDFs都能够在数据库中找到功能已知的同源序列。其中281条已提交至dbEST数据库,GenBank登陆号为JG014357JG014634。依据比对分析的结果将测序获得的TDFs归入不同的功能类型,主要包括代谢（16.7%）、基因表达调控（7.3%）、信号转导（4.4%）、能量（1.4%）和物质运输（1.5%）等。利用反转录PCR （RT-PCR）法克隆了文心兰SUS1 （SUCROSE SYNTHASE 1）和LFY基因的全长mRNA序列,GenBank登陆号分别为JF416946和HM358866。文心兰SUS1和LFY基因开放阅读框分别长2448 bp和1125 bp。序列分析发现它们与蝴蝶兰、莫氏兰等兰科植物中相应基因的同源性最高,而且与单子叶植物中相应基因的同源性高于其与双子叶植物中相应基因的同源性。对SUS1、LFY和PFT1 （PHYTOCHROME AND FLOWERING TIME PROTEIN 1）进行了定性和荧光定量表达分析,结果发现,SUS1和LFY基因的表达模式非常相似,而PFT1表达模式与前二者不同。为探索SUS1基因在花发育过程中可能发挥的功能,测定了不同组织中糖类物质的含量和蔗糖合成酶（Sucrose Synthase, SS）的活性,利用SPSS软件对测定结果及SUS1和LFY基因定量表达分析的结果进行相关性分析。结果表明,花芽中蔗糖含量及蔗糖合成酶活性与SUS1基因和LFY基因表达水平的变化趋势之间具有显著相关性。推测SUS1基因可能通过影响LFY基因表达而最终影响花发育。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 表目录
• 图目录
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.1.1 植物花发育的生理及分子生物学研究进展
• 1.1.2 LFY 基因在花发育过程中的多重功能
• 1.1.3 文心兰分子生物学研究现状
• 1.1.4 cDNA-AFLP 技术应用现状
• 1.2 研究目标和主要研究内容
• 1.2.1 主要的科学问题与研究目标
• 1.2.2 主要研究内容
• 1.3 研究技术路线
• 第二章 文心兰cDNA-AFLP 分析体系的构建
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 总RNA 提取
• 2.2.2 mRNA 分离及cDNA 合成
• 2.2.3 cDNA 双酶切
• 2.2.4 预扩增
• 2.2.5 选择性扩增
• 2.2.6 选择性扩增引物筛选
• 2.3 小结
• 第三章 文心兰花芽cDNA-AFLP 分析
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 总RNA 提取
• 3.2.2 预扩增
• 3.2.3 cDNA-AFLP 指纹图谱分析
• 3.2.4 TDFs 序列分析及功能分类
• 3.3 小结
• 第四章 TDFs 全长mRNA 克隆及表达分析
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 研究方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 SUS1、LFY 全长mRNA 序列分析
• 4.2.2 SUS1、LFY、PFT1 表达定性和定量分析
• 4.3 小结
• 第五章 糖类含量及蔗糖合成酶活性测定
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 实验方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 糖类含量测定
• 5.2.2 蔗糖合成酶活性测定
• 5.2.3 数据相关性分析
• 5.3 小结
• 第六章 结论与讨论
• 6.1 结论
• 6.1.1 文心兰cDNA-AFLP 指纹图谱分析
• 6.1.2 定性及定量表达分析
• 6.1.3 糖类含量、酶活性测定及数据相关性分析
• 6.2 讨论
• 6.2.1 关于cDNA-AFLP 实验技术
• 6.2.2 cDNA-AFLP 指纹图谱分析
• 6.2.3 TDFs 序列和功能分析
• 6.2.4 SUS1、LFY 表达水平和SS 活性之间的相关性
• 6.3 展望
• 参考文献
• 附录
• 导师简介
• 在读期间的学术研究
• 致谢