论文摘要
背景与目的:鼻咽癌（Nasopharyngeal Carcinoma,NPC）是我国南方地区的一种常见恶性肿瘤,NPC的主要治疗手段为放射治疗,但总的效果仍不够理想,NPC放疗后5年生存率仍然徘徊在40-50%。p53基因是一种重要的抑瘤基因,参与DNA损伤后修复,调控DNA损伤所触发的细胞周期运行及细胞凋亡,介导肿瘤的放射生物学效应,因此,p53与肿瘤的放射敏感性密切相关。功能失活的p53基因则不具备这些功能,导致肿瘤对放射敏感性降低,甚至使肿瘤产生放射抗拒。研究表明,60%以上的NPC组织和几乎100%的NPC细胞株有p53蛋白过表达,而且NPC中过表达的p53蛋白的功能可能异常或失活。但至今NPC中过表达的p53蛋白对NPC的放疗敏感性有无影响仍然不清楚,p53蛋白介导NPC放射应答的机制仍然需要进一步阐明。因此,观察过表达的p53蛋白对NPC放射敏感性的影响,寻找与p53介导放疗敏感性相关的蛋白质,将有助于阐明p53参与NPC放射应答的机制。方法:（1）p53沉默对人鼻咽癌细胞株CNE2放射生物学特性的影响:以稳定沉默p53基因表达的NPC细胞株CNE2sip53和对照细胞株CNE2/pSUPER为对象,采用集落存活分析法检测在不同放射剂量照射后的细胞存活分数（SF）并计算放射生物学参数D0,α,β和放射敏感比（SER）;采用MTT法检测放射线对细胞生长的影响;采用流式细胞术和Hochest33342染色检测放射线对细胞周期及凋亡的影响;（2）蛋白质组学技术寻找与p53介导CNE2细胞放疗敏感性相关的蛋白质:采用双向凝胶电泳（2-DE）技术分离CNE2sip53以及CNE2/pSUPER细胞放射前后的蛋白质,PDQuest图像分析软件识别CNE2sip53以及CNE2/pSUPER细胞放射前后的差异蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）鉴定差异蛋白质;Western blot验证差异蛋白质HSP70、Tcp-1β、Annexin A2和14-3-3σ在CNE2sip53以及CNE2/pSUPER细胞放射前后的表达水平。结果:（1）CNE2sip53细胞照射后的SF值高于CNE2/pSUPER细胞的SF;与CNE2/pSUPER细胞相比,CNE2sip53细胞照射后D0值和SF2值均增大,而α值,β值和SER均减小;（2）放射线诱导CNE2sip53细胞凋亡及对细胞增殖的抑制作用弱于其对CNE2/pSUPER细胞的作用;（3）放射线诱导CNE2/pSUPER细胞阻滞于G1期,而诱导CNE2sip53细胞阻滞于G2期;（4）建立了CNE2/pSUPER以及CNE2sip53细胞放射前后的二维凝胶电泳图谱,质谱分析鉴定了CNE2/pSUPER细胞放射前后的19个差异蛋白质以及CNE2sip53细胞放射前后的15个差异蛋白质,Western blot验证了14-3-3σ、HSP70、Tcp-1β和Annexin A2在两种细胞放射前后的差异表达水平;（5）对CNE2/pSUPER以及CNE2sip53细胞放射前后的差异蛋白质的异同进行比较分析,识别了14个不同的差异蛋白质,既Pyrophosphatase 1、Annexin A1、14-3-3 protein sigma、Proteasome（prosome,macropain）subunit、Prohibitin、Peroxiredoxin-2、Glutathionetransferase、GRP78 precursor、Cytokeratin 18、Ras-related protein、Glutathione transferase omega 1-1、NM23-H1、Calmodulin-relatedprotein和Electron transfer flavoprotein subunit alpha;生物信息学分析显示,其中7个蛋白质即Annexin A1、14-3-3 protein sigma、Proteasomesubunit、Prohibitin、Glutathione transferase、GRP78 precursor和Cytokeratin 18与p53存在直接或间接的相互作用关系。结论:（1）NPC细胞中过表达的p53蛋白具有生物学功能,参与放射诱导的NPC细胞损伤和凋亡过程;（2）采用2-DE技术建立了CNE2sip53以及CNE2/pSUPER细胞放射前后的二维凝胶电泳图谱,质谱分析鉴定了19个CNE2/pSUPER细胞放射前后的差异表达蛋白质以及15个CNE2sip53细胞放射前后的差异表达蛋白质,为研究NPC放射生物学提供了有价值的资料;（3）发现了14个不同的CNE2/pSUPER和CNE2sip53细胞放射前后的差异蛋白质,这14个蛋白质可能与p53介导NPC放疗相关,为阐明p53参与NPC放射应答的机制提供了实验依据。
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