论文摘要
目的:人禽流行性感冒（以下称人禽流感）是由禽甲型流感病毒某些亚型中的一些毒株引起的急性呼吸道传染病,人感染禽流感病毒（Avian influenza viruse,AIV）的病死率高达60%以上,对人类健康造成了巨大的威胁。近来研究认为体内高的病毒载量及过度的炎症反应造成免疫病理损伤是AIV主要的致病机制。AIV通过其表面膜蛋白-血凝素（Hemagglutinin protein,HA）与靶细胞如II型肺泡上皮细胞的相应受体结合而感染侵入细胞,这一过程诱导了细胞因子及趋化因子的大量释放,进而活化并募集巨噬细胞、中性粒细胞等炎症细胞至感染部位,导致严重的弥漫性肺泡损伤,引起一个类似急性呼吸窘迫综合症的病理生理改变以及继发的全身多器官免疫炎症性反应。然而迄今为止,缺乏针对这种免疫损伤的特效治疗药物。我们前期在SARS-CoV （severe acute respiratory syndrome - coronavirus）致病机制的研究中发现:SARS-CoV Spike蛋白能够激活宿主固有免疫应答的信号通路,诱导了细胞因子/趋化因子炎症瀑布,并且鉴定了一个关键的信号分子靶点-JAK3（Janus Kinase 3）。由于AIV与SARS-CoV在病理生理过程、临床表现等方面具有众多相似之处,我们推测禽流感病毒通过其表面膜蛋白HA,可能激活了共同的信号分子靶标介导了宿主固有免疫的病理性应答,引起急性免疫损伤。本课题因而试图通过揭示HA蛋白引起急性免疫损伤的信号转导分子机制及关键分子靶点,探讨AIV入侵始动的免疫炎症应答,阐明AIV及SARS-CoV可能的共同分子靶标,发现与鉴定能够有效对抗病毒介导的肺脏等器官的免疫损伤,有效保护免疫系统的药物靶点,为创新药物的开发奠定基础。研究内容和方法:1、制备重组禽流感病毒（H5N1）HA蛋白应用昆虫-杆状病毒真核表达系统表达重组的H5N1 HA蛋白,并经镍亲和磁珠法纯化及Western blot鉴定2、H5N1 HA蛋白诱导人肺腺癌上皮细胞株（A549）免疫损伤的可能机制不同浓度的重组HA蛋白刺激A549细胞1h后,提取总RNA; HA蛋白（40μg/ ml）刺激A549细胞不同时间（15min、30min、1h、2h、4h）后提取总RNA,RT-PCR检测IRF-1及IP-10基因表达。重组HA蛋白刺激A549细胞12h,观察其形态学变化。利用液相芯片技术检测细胞上清中细胞因子及趋化因子的变化,观察其变化的量效关系。通过Western blot方法检测JAK-STAT和NF-κB信号转导通路的活化。观察JAK3抑制剂对HA蛋白诱导的IRF-1和IP-10基因表达、细胞因子及趋化因子变化的影响。3、应用JAK3基因敲除小鼠,评价靶向JAK3对免疫损伤的保护作用JAK3基因敲除的B6129S4-Jak3tm1Ljb小鼠（JAK3-/-）及以野生型B6129SF2/J小鼠（JAK+/+）,随机分为PBS空白对照组、HA蛋白组,经气管滴注途径注入HA蛋白,72h后分离小鼠肺脏及脾脏观察病理学改变。结果:1、应用昆虫杆状病毒系统成功表达重组的H5N1 HA蛋白测序鉴定pFastbacHT-HA质粒中插入的HA基因来源于A/chicken/ Guangdong/191/04（H5N1）（GenBank;AY737289）,同源重组为Bacmid-HA质粒的PCR产物为4.1Kb,与预期相符。转染Bacmid-HA质粒的sf9细胞总蛋白经纯化后,Western blot鉴定证实为H5N1禽流感病毒HA蛋白。2、H5N1 HA蛋白诱导人肺腺癌上皮细胞株（A549）免疫损伤的可能机制HA蛋白作用于A549细胞后,细胞体积变大,细胞内颗粒增多,并出现空泡,细胞变圆有脱落,随时间延长可见细胞破碎溶解;空白对照组则无明显异常。RT-PCR检测发现HA蛋白诱导IRF-1及IP-10基因表达明显增加,呈量效及时效关系;液相芯片检测出细胞培养上清中IL-6、IL-8、MCP-1、MIP-1alpha、MIP-1beta及RANTES表达明显升高,并呈显著量效关系。Western blot检测发现HA蛋白作用于A549细胞后,诱导了STAT1、JAK2、JAK3及NF-κB磷酸化。选择性JAK3抑制剂能下调HA蛋白诱导IRF-1及IP-10基因的表达、细胞因子/炎症因子的升高及抑制JAK3及NF-κB的磷酸化。3、靶向JAK3对HA介导的免疫损伤具有保护作用JAK3+/+小鼠气管滴注HA蛋白后肺组织病理表现为弥漫性肺泡损伤,而JAK3-/-小鼠肺组织损伤明显较轻;JAK3+/+小鼠脾脏肿胀,生发中心局部结构破坏,有空泡样改变,淋巴细胞减少,而JAK3-/-小鼠脾脏基本正常。结论:一、H5N1 AIV HA蛋白通过激活JAK-STAT及NF-κB信号转导通路诱导炎症级联反应。二、JAK3分子是HA蛋白触发早期免疫炎症反应的关键信号分子。三、选择性抑制JAK3能够对抗HA蛋白诱导的免疫病理损伤,将有可能成为潜在的药物靶点;选择性JAK3抑制剂可能成为治疗病毒相关免疫损伤具有应用前景的制剂。
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