论文摘要
近年,随着低聚糖制备技术的不断发展及糖生物研究,琼寡糖巨大的应用潜力受到很多关注,已成为多糖高值化及医药、新保健食品、新化学产品等研究开发的热点。寡糖的制备仍是一个世界性难题,化学法有很多缺点：产物不单一、操作条件受限、产物的回收难等。琼胶可以被细菌分泌的琼胶酶降解得到琼胶寡糖。酶解法不但反应条件容易控制、能耗量低、催化效率高,而且酶催化有专一性,可以选择性地将糖苷键切断,从而克服化学法存在的问题。本研究以琼脂为碳源,采用涂布培养方法,再利用卢戈氏碘液反应从中国南海热带海洋环境中分离获得可降解琼脂的海洋细菌,然后在改良培养基上进一步筛选纯化出三株高活性菌株,分别编号为FG1、FG2和FG3。设计合成细菌16SrDNA通用引物1492R和968F,以基因组DNA为模板,对其16S rDNA目的片段进行PCR扩增,将获得的目的片段经过琼脂糖凝胶电泳、回收、连接和转化后,通过蓝白筛选法筛选出阳性克隆子,再利用T载体特异性引物M13R（-48）和M13F（-47）进行菌液PCR扩增,进一步对阳性克隆子进行鉴定。对克隆的16SrDNA目的片段进行测序,测序结果与GenBank数据库收录的16S rDNAs序列进行BLAST对比分析,对分离到的细菌进行分子鉴定。根据分离菌株与数据库中菌株的同源关系,利用MEGA5软件构建系统发育树,确定细菌的分类学地位。用3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法测定琼胶酶将反应液中的琼脂降解为还原性寡糖的含量,研究不同培养条件下细菌的产酶活性,再利用正交试验方法研究了培养基中琼胶浓度、盐度和培养温度对细菌产酶的影响,优化产酶条件；同时研究分析了pH、温度对酶活性的影响；利用硫酸铵沉淀法制备蛋白质粗提物,采用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色技术构建蛋白质图谱。该研究获得了大量具有琼胶降解活性的海洋细菌,在此基础上通过培养基的改良和培养条件的优化,进一步筛选、纯化出了三株高活性菌株,分别编号为FG1、FG2和FG3,均为革兰氏阴性菌。三种细菌在琼脂固体培养基（不含葡萄糖或蔗糖）上培养2-3d后,菌落周围的固体培养基明显液化或产生较大的孔洞,1周内固体培养基完全液化。研究发现三种细菌的琼胶降解活性具有良好的遗传稳定性。利用PCR技术克隆获得了三种细菌的16S rDNAs目标片段（FG1、FG2和FG3其16S rDNA序列在GenBank中的收录号分别为JX073661、JX073662和JX073663）,其中FG1与聚团拉布伦茨氏菌（Labrenzia agregata）两者16S rDNA序列的同源性为99%,初步鉴定为拉布伦茨氏菌属（Labrenzia sp.）; FG2与哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）两者16S rDNA序列的同源性为99%,初步鉴定为弧菌属（Vibrio sp.）;FG3与星箭头菌（Sagittula stellata）两者16S rDNA序列的同源性为97%,初步鉴定为箭头菌属（Sagittula sp.）。产琼胶酶条件优化的研究结果表明：FG1和FG3在琼脂浓度为0.9～1.5%的培养基上,具有较强的产琼胶酶活性,其中,FG1最适产酶琼脂浓度为1.2%,酶活性浓度为2793U/mL,FG3最适产酶琼脂浓度为1.5%,酶活性浓度为3266.6U/mL；FG2在琼脂浓度为0.5～0.9%的培养基上,具有较强的产琼胶酶活性,最适产酶琼脂浓度为0.7%,酶活性浓度为2066.6U/mL。在培养基盐度为31.320～32.625时,FG1表现出较强的产琼胶酶活性,盐度为31.97时产酶活性最强,酶活性浓度为2786.6U/mL,FG2和FG3在盐度为30.67～31.32的培养基上均具有较高的产琼胶酶活性,FG2和FG3的最适产酶培养基盐度均为30.67,酶活性浓度分别为1914.6U/mL和3135.4U/mL。培养温度为27～31℃条件下,FG1和FG2均有较强的产酶活性,其中FG1的最适产酶温度为31℃,酶活性浓度为2715.4U/mL,FG2的最适产酶温度为27℃,酶活性浓度为1653.4U/mL；FG3具有较为广谱的产酶温度,培养温度为20～31℃条件下,均表现出较强的产琼胶酶活性,但其最适产酶温度为27℃,酶活性浓度为2906.6U/mL。上述因子的正交试验结果表明：FG1的最适产酶条件是琼脂浓度1.2%、盐度31.97、温度31℃、pH7.2,酶活性浓度高达2815.4U/mL；FG2的最适产酶条件是琼脂浓度0.5%、盐度30.67、温度27℃、pH7.2,酶活性浓度高达2213.8U/mL；FG3的最适产酶条件是琼脂浓度1.5%、盐度31.97、温度27℃、pH7.2,酶活性浓度高达3415.8U/mL。酶反应活性条件的研究结果表明：FGl产生的琼胶酶,反应介质pH在7.4～8.4时,酶具有较强的活性,当pH为8.0时酶活性最强,比活力为3480U/mL；FG2产生的琼胶酶,反应介质pH在8.0～9.0时,酶具有较强的活性,当pH为8.0时酶活性最强,比活力为2106.6U/mL;FG3产生的琼胶酶,反应介质pH在7.4～9.0时,酶具有较强的活性,当pH为8.0时酶活性最强,比活力为3746.6U/mL。FG1和FG2所产琼胶酶的较强活性温度为30～40℃,其中,FG1所产琼胶酶的最适活性温度为35℃,酶比活力为3654U/mL；FG2所产琼胶酶的最适活性温度为30℃,酶比活力为2016U/mL；FG3所产琼胶酶的较强活性温度为30～50℃,其所产琼胶酶的最适活性温度为40℃,酶比活力为4041U/mL。该研究同时发现：三种海洋细菌琼胶酶基因表达调控方式为诱导表达型调控,即在有且只有琼胶作为碳源的情况下,细胞内的琼胶酶基因才得以表达,且琼胶酶具有很强的琼胶降解活性。琼胶降解酶基因的表达调控仍有待进一步研究分析。