茶树酯型儿茶素生物合成代谢相关酶检测方法及初步纯化研究

论文摘要

儿茶素是茶树的重要次生代谢产物，不仅是构成茶叶品质的主要化学成分，也是茶叶的主要药理功能成分。其中酯型儿茶素的保健功能要高于非酯型儿茶素。茶树中非酯型儿茶素的生物合成途径业已清晰，但酯型儿茶素的合成代谢途径及分子调控机理仍是研究难题。本课题前期工作发现，茶树酯型儿茶素合成途径包含两步反应，即没食子酸（gallic acid, GA）先在UDPG的没食子酰葡萄糖基转移酶（UDP-glucose:galloyl-1-O-β-D-glucosyltransferase，UGGT）作用下，形成1-O-没食子酰-β-D-葡萄糖（βG）。βG作为活化的没食子供体，在表儿茶素没食子酰基转移酶（epicatechin:1-O-galloyl-β-D-glucose O-galloyltransferase，ECGT）的作用下，将没食子基团转移到非酯型表儿茶素的C环-3-位点上，形成酯型儿茶素。同时酯型儿茶素也可以被茶树中酯型儿茶素水解酶（galloylated catechins hydrolase, GCH）水解成非酯型儿茶素和没食子酸。本文以茶树鲜叶为材料，研究GCH、UGGT和ECGT活性检测体系的影响因素（包括最适反应时间、最适温度、最适pH、最适底物浓度），建立较为简单的酶活性检测方法，为进一步分离纯化酶蛋白，打下良好的基础；并利用蛋白质分离纯化技术对GCH进行了初步纯化。旨在为深入探讨茶树儿茶素合成及其代谢的分子机制奠定基础。主要研究结果如下：1.利用高效液相色谱方法，对GCH、UGGT及ECGT酶的酶促反应产物进行了定性的检测。2.建立了GCH、UGGT及ECGT三种酶的最适检测体系。分别为：（1）G CH最适反应体系：2.5mL反应体系包括0.2mmol/L EGCG（ECG或GCG），4mmol/L抗坏血酸，0.1mol/L磷酸缓冲液（pH6.5），粗酶提取液若干（含0.4mg蛋白），于30℃下反应30min。（2）UGGT最适反应体系：1.5mL反应体系包括1.4mmol/L GA，2.3mmol/L UDPG，4mmol/L抗坏血酸，1.5mmol/L水杨酸，0.1mol/L磷酸缓冲液（pH6.0），粗酶提取液若干（含0.55mg蛋白），于30℃下反应90min。（3）ECGT最适反应体系：1.5mL反应体系包括0.38mmol/L EGC或EC，0.8mmol/L1-O-没食子酰-β-D-葡萄糖（βG），4mmol/L抗坏血酸，1.5mmol/L水杨酸，0.1mol/L磷酸缓冲液（pH6.0），粗酶提取液若干（含0.55mg蛋白），于30℃下反应60min。3.利用硫酸铵分级沉淀、Q Sepharose FF离子交换层析和Superdex200凝胶层析对GCH进行了分离纯化，其比活力增加了1.71倍,回收率为9.9％。用SDS-PAGE检测纯化后酶的纯度，结果显示分离效果有待进一步提高。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 儿茶素的结构
• 1.2 非酯型儿茶素的合成途径及其相关的酶类
• 1.3 酯型儿茶素合成途径
• 1.4 酯型儿茶素合成途径中的相关酶
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 材料、试剂与仪器
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 主要药品和试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 粗酶液制备
• 3.2.2 酶蛋白含量测定
• 3.2.3 酶反应体系
• 3.2.4 酯型儿茶素水解酶（GCH）最佳检测体系的建立
• 3.2.5 依赖 UDPG 的没食子葡萄糖苷转移酶（UGGT）检测体系的建立
• 3.2.6 表儿茶素没食子酰基转移酶（ECGT）检测体系的建立
• 3.2.7 酯型儿茶素水解酶的分离纯化
• 3.2.8 SDS-PAGE 电泳
• 3.2.9 酶反应产物的检测方法
• 4 结果与分析
• 4.1 酶产物的检测
• 4.2 酯型儿茶素水解酶（GCH）检测体系的建立
• 4.2.1 反应体系的最适反应时间
• 4.2.2 反应体系的最适温度
• 4.2.3 反应体系的最适 pH 值
• 4.2.4 反应体系的最适底物浓度
• 4.3 依赖 UDPG 的没食子葡萄糖苷转移酶（UGGT）的检测体系的建立
• 4.3.1 反应体系的最适反应时间
• 4.3.2 反应体系的最适温度
• 4.3.3 反应体系的最适 pH 值
• 4.3.4 反应体系的最适底物 GA 浓度
• 4.3.5 反应体系的最适底物 UDPG 浓度
• 4.4 表儿茶素没食子酰基转移酶（ECGT）的检测体系的建立
• 4.4.1 反应体系的最适反应时间
• 4.4.2 反应体系的最适温度
• 4.4.3 反应体系的最适 pH 值
• 4.4.4 反应体系最适底物 EGC 浓度
• 4.4.5 反应体系最适底物βG 浓度
• 4.5 酯型儿茶素水解酶的初步分离纯化
• 4.5.1 硫酸铵分级沉淀
• 4.5.2 离子交换层析
• 4.5.3 凝胶层析
• 4.5.4 初步分离纯化的电泳分析
• 5 讨论
• 5.1 茶树酯型儿茶素的合成及其代谢
• 5.2 UGGT、ECGT 和 GCH 活性最适检测体系
• 5.3 GCH 的初步分离纯化
• 6 结论
• 参考文献
• 附录及缩略词
• 致谢
• 作者简介