热休克蛋白90抑制剂17-AAG抗肾细胞癌作用的机制研究

论文摘要

第一部分HIF-2α、Hsp90和VEGF在肾细胞癌中的表达及临床意义目的研究肾细胞癌中缺氧诱导因子2（HIF-2α）、热休克蛋白90（Hsp90）和血管内皮生长因子（VEGF）的表达及与临床病理特征之间的关系,并探讨三者之间及与肾细胞癌患者预后的关系。方法应用免疫组织化学（IHC）S-P法检测60例肾细胞癌及25例正常肾组织中HIF-2α、Hsp90和VEGF表达与分布,分析其间的相关性及与肿瘤临床病理特征之间的联系,根据随访资料探讨上述三者与肾细胞癌患者预后的关系。应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫印迹（western blot）法检测HIF-2α及VEGF mRNA的表达。结果免疫组化S-P法检测中肾细胞癌标本HIF-2α、Hsp90和VEGF的表达明显高于正常肾组织,差别具有统计学意义。三个指标之间,两两呈显著正相关。HIF-2α、Hsp90和VEGF的表达与肾癌的分期、淋巴转移、肿瘤大小及局部侵润有关。上述三者与肾细胞癌患者生存期之间关系的分析提示HIF-2α阴性组肾细胞癌患者的生存率高于阳性组,差异有统计学意义,Hsp90阴性组生存率有高于阳性组的趋势,接近于统计学水平,VEGF阳性组病例的预后显著差于阴性组,有统计学意义。RT-PCR和western blot法检测中HIF-2α只在蛋白水平增高,VEGF在mRNA和蛋白水平均增高。结论在人肾细胞癌中HIF-2α、Hsp90和VEGF基因高表达,且HIF-2α、Hsp90和VEGF三者表达之间有显著正相关。HIF-2α和VEGF是影响肾细胞癌预后的独立因素。HIF-2α可能通过上调VEGF表达而在肾细胞癌的发生发展中起重要作用。Hsp90与HIF-2α密切相关,可能二者在肾细胞癌的发生发展中共同作用。第二部分Hsp90抑制剂17-AAG对人肾癌细胞生物学行为影响的体外研究目的观察Hsp90抑制剂17-AAG对体外培养的人肾癌细胞株Caki-1细胞的作用。方法将Hsp90抑制剂17-AAG加入人肾癌细胞株Caki-1中（实验组）,分别在常氧和缺氧状态下进行培养。同时设立阴性对照组和空白对照组。MTT法检测三组细胞增殖能力。Hoechst 33342和PI双染法观察细胞凋亡,AnnexinV-FITC/PI双染法和DNA ladder检测细胞凋亡。western blot法检测HIF-2α和VEGF蛋白表达。结果对数生长周期的三组细胞在常氧状态下的增殖活性无明显区别。而实验组细胞在缺氧48小时后生长能力逐渐下降,细胞增殖明显滞后于前两组细胞,差异有统计学意义。缺氧状态下实验组的凋亡率明显增高,而阴性对照组和空白对照组细胞的凋亡率尽管也增多,但增高幅度较小,与实验组比较,差异有统计学意义。常氧状态下,实验组细胞HIF-2α和VEGF蛋白表达受到抑制,明显低于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义。在模拟缺氧24小时后,阴性对照组和空白对照组的HIF-2α和VEGF蛋白表达明显增强,与常氧时比较差异有统计学意义。而实验组细胞HIF-2α和VEGF蛋白表达虽然有所增加,但幅度较小,与常氧时比较差异无统计学意义。结论在体外,Hsp90抑制剂17-AAG能抑制Caki-1细胞增殖,促进凋亡,并能抑制人肾癌细胞株Caki-1的HIF-2α和VEGF基因表达。第三部分Hsp90抑制剂17-AAG对人肾细胞癌抑制作用的体内研究目的在整体水平（裸鼠皮下移植瘤）研究Hsp90抑制剂17-AAG对人肾细胞癌生长的作用。方法建立人肾细胞癌裸鼠皮下移植瘤模型,在模型中按125mg/kg体重标准,在瘤体内分别注射17-AAG、DMSO和生理盐水,观察抑瘤效果,IHC S-P法检测HIF-2α和VEGF蛋白表达,TUNEL和透视电镜检测凋亡。结果实验组裸鼠皮下移植瘤的生长明显受到抑制。体积增长明显慢于空白对照组和阴性对照组,差别有统计学意义。同时重量明显轻于空白对照组和阴性对照组,差别有统计学意义。实验组裸鼠皮下移植瘤HIF-2α和VEGF蛋白表达弱于对照组,差别有统计学意义。实验组裸鼠皮下移植瘤凋亡指数（AI）明显小于对照组。结论在体内实验中,Hsp90抑制剂17-AAG能明显抑制人肾细胞癌的生长,促进凋亡,可能有下调HIF-2α和VEGF的表达的作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 Hsp90α、HIF-2α、VEGF在肾细胞癌中的表达及临床意义
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第二部分 Hsp 90抑制剂17-AAG对人肾癌细胞生物学行为影响的体外研究
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第三部分 Hsp 90抑制剂17-AAG对人肾细胞癌抑制作用的体内研究
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 全文总结
• 综述 缺氧诱导因子与肿瘤的研究
• 全文缩略词
• 攻读研究生期间发表的论文
• 致谢