蝎毒BmBKTx1结构与功能的研究前体蛋白加工酶furin的研究

论文摘要

本论文主要涉及三个方面的工作。第一部分:蝎毒BmBKTx1双功能面的研究;第二部分:前体蛋白加工酶furin在胞内定位的研究;第三部分:基于组蛋白H1.2片段的furin抑制剂的研究。1.蝎毒BmBKTx1双功能面的研究在漫长的3.5亿年的生存选择中,蝎子逐渐进化出了形形色色,功能各异的神经活性多肽,这些多肽是它们进攻与防御的主要武器,大多作用于各类Na+和K+通道。钾离子通道是生物体中最基础的功能蛋白之一,对钾离子有高度离子选择通透性,在生理的变化过程中起着重要的作用。目前,蝎活性多肽已经成为研究K+通道的药理,生理,结构和功能特性的最有力的工具。BmBKTx1是从东亚马氏钳蝎中纯化到的一个新型短链毒素。它由31个氨基酸残基组成,含3对二硫键,与SK（低电导钙激活型钾通道）毒素的一级结构比较相似,但仅仅具有比较弱的SK阻断活性。实验表明BmBKTx1对高电导钙激活型钾通道（BK）有明显的抑制作用,同时它不具有对电压门控型钾通道（Kv）的抑制活力。BmBKTx1是第一个报道的能同时作用于BK和SK的蝎毒素,它具有一定的昆虫选择性,也是第一个能作用于果蝇BK通道（dSlo）的蝎毒素。BmBKTx1是第一个被确认的能够同时作用于BK通道和SK通道的蝎毒素。它有可能是通过两个不同的功能面来作用于这两个通道。为了证明这个假设,本文在大肠杆菌中重组表达了BmBKTx1的野生型和它的两个突变体,K21A-Y30A和R9A-K11A,并测定了它们对蟑螂的BK通道（pSlo）和大鼠的SK2通道的阻断活性。结果表明突变体K21A-Y30A对BK通道的阻断活性有着明显的降低,但是对SK通道的阻断活性没有变化。而突变体R9A-K11A对BK通道和SK通道的阻断活性均没有变化。这些结果证实了BmBKTx1具有双功能面的假设,并且确认了它的BK功能面位于毒素C端的β折叠上。这些结果可以促进BmBKTx1在BK通道疾病的治疗,搜寻钾通道毒素,以及杀虫剂等方面的应用开发。2.Mint3与furin相互作用调控了furin在高尔基体上的定位多肽或蛋白质以前体形式合成后,需要前体蛋白加工酶的剪切才能获得完全的生物活性。这些前体蛋白加工酶成为生物体内重要的生理病理过程的调控者。Furin是发现得最早且功能研究最为清楚的哺乳动物前体加工酶,许多重要的生理过程需要furin的参与,如多肽与蛋白质激素的合成与分泌、膜受体的成熟、血浆蛋白前体的激活等;同时多种疾病的发生也与furin密切相关,如病毒外壳蛋白和细菌外毒素的加工活化以及肿瘤的转移等。现阶段虽然对furin的细胞内定位和自身加工成熟有较多研究,但很多具体机制和细节并不清楚。因此,对furin相互作用蛋白质的鉴定和功能分析不仅具有重要的理论意义,也有利于开发抗病毒和抗细菌外毒素的先导药物。前体加工酶furin在细胞内分泌后,在质膜,内吞体和高尔基体（TGN）之间循环,主要分布于高尔基体。Mint3是Mint接头蛋白家族的成员,可以调控膜蛋白的运输和分泌。迄今为止,对于在furin的运输和定位过程中,mint3所起的作用仍然了解得很少。本文通过免疫共沉淀和免疫荧光共定位的实验,证明了mint3和furin可以相互作用,并且它们在HeLa细胞里共定位于高尔基体。通过RNA干扰的方法下调内源mint3的表达之后,furin的高尔基体定位被破坏,同时增加了其在内吞体中的分布。进一步的实验表明mint3通过PTB结构域（phosphotyrosinebinding domain）与furin相结合,并调控了furin在高尔基体上的定位。此外,对furin进行突变发现,mint3主要通过和furin的酸性多肽信号区相互作用来调节furin的分布。我们的实验结果第一次发现,mint3通过PTB结构域与furin的酸性多肽信号区相互作用调控了furin在高尔基体上的特异性定位。这些结果阐明了一条新的furin在细胞内定位和转运的途径,提供了furin相关疾病的新的药物靶点,有利于治疗学方面的发展。3.基于组蛋白H1-2片段的furin抑制剂的设计改造在哺乳动物的许多生理和病理活动中,前体加工酶furin起到了非常重要的作用,例如对病毒糖蛋白和细菌毒素的激活。寻找小分子量,无毒性,高活力的furin抑制剂是解决该类疾病的非常有吸引力的药物设计途径。本文根据furin的抑制剂histone H1.2的C端片段设计和合成了一系列的短肽抑制剂。将抑制剂的活性位点替换成为furin的最佳底物识别位点,可以极大地增强抑制剂的抑制活性。在所设计的短肽抑制剂中,抑制活力最好的是一条14肽的抑制剂,对furin的抑制常数Kj达到17nM。尽管大多数合成的短肽都是可逆性的抑制剂,但是其中的一条9肽对furin有很高的稳定性,在37℃共保温3h后仍保留有全部的抑制活力。这些短肽抑制剂可以成为新的furin介导疾病的药物设计模板。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 蝎毒的分类和功能综述
• 1.1 蝎钾离子通道毒素（KTx）
• 1.1.1 钾离子通道
• 1.1.2 KTx的分类
• 1.1.3 KTx的结构与功能
• 1.1.4 KTx与钾离子通道的结合模式
• 1.1.5 KTx的功能对假说
• 1.1.6 KTx的进化
• 1.2 蝎钠离子通道毒素
• 1.2.1 钠离子通道
• 1.2.2 钠离子通道毒素的分类
• 1.2.3 α类毒素的分类
• 1.2.4 β类毒素的分类
• 1.2.5 钠离子通道毒素的结构
• 1.3 蝎氯离子通道毒素和钙离子通道毒素
• 1.4 结语
• 参考文献
• 第二章 蝎毒BmBKTx1双功能面的研究
• 摘要
• Abstract
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 材料和仪器
• 2.2.2 表达和纯化
• 2.2.3 重组毒素二硫键配对确认
• 2.2.4 圆二色谱测定
• 2.2.5 重组毒素活性测定
• 2.3 结果
• 2.3.1 BmBKTx1的突变体的设计
• 2.3.2 重组毒素的表达和纯化
• 2.3.3 重组毒素二硫键配对确认
• 2.3.4 圆二色谱测定
• 2.3.5 重组毒素活性测定
• 2.4 讨论
• 2.4.1 BmBKTx1和BK通道的相互作用
• 2.4.2 BmBKTx1和SK通道的相互作用
• 2.4.3 BmBKTx1的BK通道和SK通道的双阻断功能面
• 2.4.4 BmBKTx1在HIV治疗上的应用前景
• 2.4.5 BmBKTx1的独一性
• 2.5 总结
• 2.6 致谢
• 参考文献
• 第三章 前体蛋白加工酶furin的综述
• 3.1 蛋白前体加工酶（proprotein convertase,PC）研究简述
• 3.1.1 蛋白前体加工酶的发现
• 3.1.2 蛋白前体加工酶的分类和组织分布
• 3.2 哺乳动物前体加工酶的结构
• 3.2.1 一级结构
• 3.2.2 晶体结构
• 3.3 前体加工酶的翻译后加工与细胞内分拣定位
• 3.3.1 细胞分泌机制
• 3.3.2 Furin的成熟与双循环机制
• 3.4 Furin的生物学功能
• 3.5 Furin抑制剂的研究
• 3.5.1 小分子抑制剂
• 3.5.2 蛋白质大分子抑制剂
• 3.6 总结
• 参考文献
• 第四章 Mint3与furin的相互作用调控了furin的高尔基体定位
• 摘要
• Abstract
• 4.1 前言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 细胞培养及转染
• 4.2.3 免疫共沉淀和蛋白质印迹
• 4.2.4 免疫荧光检测
• 4.2.5 细胞膜表面furin荧光活性的检测
• 4.2.6 Furin基因的获得及其CA、P、CY结构域和各突变体的表达
• 4.2.7 GST-pull down
• 4.2.8 人Mint3基因的克隆及各结构域的克隆表达
• 4.2.9 鼠Mint3基因的克隆及GFP/PTB、GFP/△PTB融合蛋白的克隆
• 4.2.10 His-tag pull down
• 4.2.11 Mint3 RNAi质粒的构建
• 4.3 结果
• 4.3.1 Furin与Mint3存在相互作用
• 4.3.2 Mint3调控了furin在高尔基体上的定位
• 4.3.3 Mint3通过其PTB结构域与furin相互作用
• 4.3.4 Mint3主要与furin细胞质结构域的酸性多肽信号区结合
• 4.4 讨论
• 4.5 致谢
• 参考文献
• 第五章 基于histone H1.2的furin抑制剂的设计改造
• 摘要
• Abstract
• 5.1 前言
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 材料
• 5.2.2 短肽抑制剂的合成
• 5.2.3 短肽抑制剂的纯化
• i值测定和稳定性测定'>5.2.4 短肽抑制剂的K_i值测定和稳定性测定
• 5.2.5 HPLC分析短肽抑制剂的稳定性
• 5.3 结果
• 5.3.1 抑制剂对furin的抑制活力
• 5.3.2 抑制剂的最优化设计
• 5.3.3 抑制剂的稳定性测定
• 5.3.4 HPLC分析短肽抑制剂的稳定性
• 5.4 讨论
• 5.5 致谢
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文与取得的研究成果