论文题目: LiCl对Hcaf细胞凋亡及HSP70表达的影响和LiCl、HSP70对615小鼠的抑瘤作用
论文类型: 博士论文
论文专业: 外科学
作者: 杨野
导师: 郭仁宣
关键词: 热休克蛋白,氯化锂,细胞,凋亡
文献来源: 中国医科大学
发表年度: 2005
论文摘要: 前言热休克蛋白（HSPs）是生物体在应急条件下产生的一组蛋白,又称为应急蛋白（stress protain）,广泛存在于原核真核生物中,高度保守。目前可分为HSP90、HSP70、HSP60及小HSP60四个家族。HSP70在正常细胞中广泛存在,多存在于细胞内,正常细胞中水平较低,应激状态下显著增高。但研究发现在许多肿瘤细胞中HSP70过表达。HSP70在正常细胞表面不表达,被认为是肿瘤细胞表面的特异性结构。研究发现引起肿瘤免疫应答的成分是HSP70,而肿瘤细胞的HSP70序列与正常组织细胞的HSP70序列几乎完全相同,进一步研究发现肿瘤免疫应答的关键是HSP70结合的小肽。由此认为来源于肿瘤细胞HSP70的肿瘤肽,具有肿瘤免疫作用。锂盐在临床上主要用于治疗精神方面疾病,也可升高外周血中肿瘤坏死因子（TNF）的水平,使细胞对TNF介导的凋亡和坏死敏感。锂盐有相对宽泛的安全范围,常可以在未显示其毒性的情况下上调TNF水平。安全、通常不致出现副反应是其特点。HSP70在肿瘤细胞中高表达,是肿瘤细胞进行增殖和生存所必需,且可通过抑制其表达诱发肿瘤细胞凋亡而抑制肿瘤的增殖。HSP70与人单核细胞表面结合,能刺激单核细胞产生TNF-a等细胞因子,也可诱导体内的T细胞高表达TNF-a等细胞因子,达到抑制肿瘤细胞生长及杀伤肿瘤细胞的目的。锂盐可以升高TNF-α等细胞因子的水平,并能直接影响c-fos等原癌基因的表达;而Hcal细胞的HSP70携有肿瘤肽能激发机体的抗肿瘤免疫,同时也可升高IL-2、TNF-α等细胞因子的水平,达到抑制肿瘤生长的目的。本试验对纯系615小鼠的Hcaf肿瘤细胞,通过超声粉碎、层析,梯度洗脱、纯化、鉴定,获得肿瘤来源的HSP70;并研究不同剂量LiCl对体外培养的Hcal细胞的作用及对Hcal细胞的HSP70表达的影响;还通过应用LiCl、Hcaf细胞的HSP70和健康小鼠组织的HSP70作用于由Hcaf细胞建立起来的615小鼠肿瘤模型,观察小鼠外周血中细胞因子TNF-α的变化及抗肿瘤效果。材料与方法第一部分实验经过对Hcaf细胞超声粉碎,20000r/min,高速冷冻离心1小时,经ConA-sepharose柱层析,收集未结合部分透析,经DEAE柱层析,用FPLC-system梯度洗脱结合在DEAE柱上的部分,收集各个峰值的蛋白样品,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）证明C峰的样品为分子量70KD的蛋白。经过蛋白免疫印迹（Western-blotting）验证,此样品为HSP70。经过纯化、冷冻抽干、过滤除菌,-70℃保存。以备进行HSP70的抗肿瘤实验。第二部分实验应用LiCl、HcaF细胞的HSP70和健康小鼠组织的HSP70作用于由HcaF细胞建立起来的615小鼠肿瘤模型,观察小鼠外周血中细胞因子TNF-α水平的变化及抗肿瘤效果。第三部分实验通过不同剂量的LiCl,作用于用RPMI-1640培养液体外培养的Hcaf细胞的作用,在不同时间点取样,分别用碘化丙锭（PI）、兔抗小鼠HSP70抗体和FITC标记的羊抗兔IgG抗体染色,观察Hcaf细胞周期变化及对Hcaf细胞HSP70表达的影响,并通过扫描电镜观察Hcaf细胞的超微结构。结果第一部分实验经对HcaF细胞超声粉碎、离心、层析,用FPLC-system梯度洗脱,收集各个峰值样品,C峰的样品经SDS-PAGE证明为70KD蛋白,经Western-blotting验证为HSP70:第二部分给予健康的615小鼠组织的HSP70对肿瘤组织的抑制作用与对照组相比差别不显著;与对照组比较,LiCl组和Hcaf细胞HSP70组的抑瘤作用差别显著,但两组之间抑瘤作用差别无统计学意义;合用LiCl和Hcaf细胞HSP70组,抑瘤作用最显著。正常组织的HSP70注射后TNF-a略升高,但与对照组相比无统计学意义。LiCl组,Hcaf细胞HSP70组的TNF-a升高,P＜0.05有统计学意义;LiCl与Hcaf细胞HSP70合用组TNF-a升高与单用LiCl,Hcaf细胞HSP70组比较,无显著差别。第三部分实验组细胞8小时,24小时,48小时“亚二倍体峰”逐渐增大,G0/1期DNA含量逐渐减少,二倍体峰缩小;G2M期DNA含量升高,四倍体增加;S期的DNA含量也增加,而对照组细胞生长良好,细胞周期未见“亚二倍体峰”,结果显示经氯化锂处理后,Hcaf细胞发生周期阻滞;第三部分实验组的Hcaf细胞经LiCl处理8小时后,FITC标记的HSP70平均荧光强度增高,显示实验组同对照组比较HSP70表达增强。对照组的荧光强度与单用二抗比较无明显升高。氯化锂（60ug/ml）组作用8小时,收集的Hcaf细胞经透射电镜观察的结果:显示Hcaf细胞体积变大,边缘可见vi;胞质变化不明显,核大,可见核仁,异染色质积聚成团块状,分布在核仁内侧;细胞边缘膨出,起泡,Vi;细胞出现凋亡小体,细胞发生凋亡。结论1.Hcaf细胞经超声波粉碎,ConA-sepharose柱和DEAE柱层析,洗脱,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western-blotting鉴定:FPLC-system洗脱收集得到的C峰蛋白为热休克蛋白70。2.LiCl,Hcaf细胞来源的HSP70可以升高615小鼠外周血中的TNF-a水平,有抑制肿瘤生长的作用。3.LiCl和Hcaf细胞来源的HSP70合用可以升高615小鼠外周血中的TNF-a水平,抑瘤作用显著;健康615小鼠组织来源的HSP70与对照组比较抑瘤作用不明显4.LiCl对体外培养的Hcaf肿瘤细胞的生长有抑制作用;能增强体外培养的Hcaf细胞HSP70的表达。
论文目录:
一、摘要
1.中文论著摘要
2.英文论著摘要
二、英文缩略语
三、论文
论文一 615小鼠Hcaf细胞HSP70的实验研究
1.前言
2.材料与方法
3.结果(附论文图片)
4.讨论
5.结论
论文二 LiCl对HcaF细胞的凋亡作用及对热休克蛋白70表达的影响
1.前言
2.材料与方法
3.结果(附论文图片)
4.讨论
5.结论
论文三 HSP70,LiCl对615小鼠外周血中细胞因子TNF的影响及抗肿瘤作用
1.前言
2.材料与方法
3.结果(附论文图片)
4.讨论
5.结论
四、本研究创新性的自我评价
五、参考文献
六、附录
1.综述
2.在学期间科研成绩
3.致谢
4.个人简介
发布时间: 2010-04-14
参考文献
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