扇贝微卫星标记的筛选及其在物种鉴定中的应用

论文摘要

扇贝作为重要的经济贝类,其养殖业被迅速的开展起来,逐渐成为我国重要的增养殖贝类,而飞速发展的分子标记辅助育种体系为优良品种的快速培育提供了理论基础和实践经验。微卫星标记作为一种新兴的分子标记技术,加之其自身的优点,在扇贝遗传分析上的应用也日益得到重视。本研究以四种扇贝（栉孔扇贝、海湾扇贝、华贵栉孔扇贝和虾夷扇贝）为研究材料,筛选了四种扇贝的微卫星标记并对微卫星标记在扇贝肌肉柱和幼虫鉴定中的应用进行了探讨。1栉孔扇贝微卫星标记的筛选搜索NCBI dbGSS数据库,得到栉孔扇贝序列3648条。用软件“Repeat Reporter Version1.5”查找得到核心序列为三碱基、四碱基的微卫星序列。经序列比对和引物设计、优化以及多态性检测后,共筛选得到24个具有多态性的标记,等位形式在2-9之间,平均等位形式数目为5.1。Ho和He的范围各自为0.000 -0.7500和0.1866-0.8495,各位点之间没有明显的连锁不平衡现象,经Markov chain test检验24个位点中有12个偏离Hardy-Weinberg平衡。2海湾扇贝微卫星标记的筛选搜索NCBI dbEST数据库中所有栉孔扇贝的EST序列7060条,并用软件搜索了所有可能的核心序列为两碱基、三碱基、四碱基、五碱基及六碱基的微卫星序列,结果193条序列符合严谨度,占整个ESTs库的2.73%。其中:两碱基重复含量>三碱基重复>五碱基重复>四碱基重复>六碱基重复。两碱基重复的微卫星含量最高的是（AT）n,其次是（AG）n,再次之为（AC）n。最后筛选得到20个多态性引物,共扩增得到92个等位基因,每个位点扩增得到的等位基因个数为2-11个,平均每对引物扩增出4.6个等位形式。观测到的杂合度和期望杂合度范围分别为0.0667-0.8000和0.0961-0.8253。3华贵栉孔扇贝微卫星标记的筛选以华贵栉孔扇贝为材料,基因组DNA经Rsa I进行酶切,经过膜富集（AC）n和（AG）n后构建了华贵栉孔扇贝微卫星富集文库。运用菌落原位杂交的方法,使用（AC）n和（AG）n为探针经过杂交后,筛选得到阳性克隆,经测序共获得了60个华贵栉孔扇贝的微卫星序列,设计的22对引物中,10对引物的扩增产物具有多态性,等位基因数目从3到6个不等,平均等位形式数目为4.2,观测杂合度和期望杂合度从0-0.88和0.29-0.76。4虾夷扇贝微卫星标记的筛选同上用富集文库的方法（HaeIII）筛选虾夷扇贝的微卫星标记,筛选得到的12个多态性位点中,扩增得到的等位基因从2个到8个不等,平均每个位点得到4.5个等位基因。观测到的杂合度范围为0-0.8333,期望杂合度范围为0.2546-0.8231。以上表明,这些微卫星标记都具有较高的多态性,均具有较高的信息含量,适合进行各种遗传学分析。5物种特异性微卫星标记的筛选及灵敏度检测本研究共采用了72个微卫星标记进行物种特异性标记的确认。最后选取了8个在任何温度下只能在目的物种中扩增得到DNA片段的标记作为鉴定用标记。用幼虫进行灵敏度检测,结果显示各标记的检测灵敏度非常高:为2%和1%,该标记系统为扇贝的物种鉴定以及生态学调查提供了实验依据。6扇贝肌肉柱及幼虫鉴定本研究利用以上8个标记组成的鉴定系统对三种产品（冷冻、干品和罐头）的7批样品进行了鉴定。结果显示,6批次的样品分别是单一物种组成的。其中编号为DM3的样品经过WAVE检测后发现,此批样品是栉孔扇贝和海湾扇贝的混合物。单个模板扩增的PAGE检测结果显示其中4个样品是栉孔扇贝,16个样品为海湾扇贝,因此,我们可以基本确定此批样品中栉孔扇贝和海湾扇贝的所占的百分比分别为20%和80%。实验没有检测到华贵栉孔扇贝样品。对于杂交幼虫的鉴定,结果显示:所有从养殖场取得的10批样品全部在某一物种处出现条带或者检测峰,说明样品中的杂样应该低于1%（灵敏度）。反复取样的结果显示所有的幼虫都是由单一物种组成的。实验随机选取了4批大池幼虫,从中任意挑选至少72个个体进行单一幼虫模板的PCR扩增结果显示336个幼虫中306（91.1%）个扩增成功,结果显示所有的幼虫都是种内杂交产生。基于本研究结果,我们认为物种特异性微卫星标记能够在扇贝商品鉴定和幼虫鉴定中发挥巨大的作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 分子标记技术的发展概况
• 1.1 RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性）
• 1.2 RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态DNA）
• 1.3 AFLP（Amplified Fragment Length Polymorhism，扩增片段长度多态性）
• 1.4 Microsatellites （或 SSRs，Simple Sequence Repeats，简单序列重复）
• 1.5 SNP（Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性）
• 2 微卫星标记的开发及在水产动物研究中的应用
• 2.1 微卫星标记的筛选方法
• 2.2 微卫星标记在水产动物研究中的应用
• 3 微卫星标记在扇贝生物学研究中的应用
• 3.1 我国主要扇贝的种类及其外部特征
• 3.2 微卫星标记在扇贝中的应用
• 4 动物物种鉴定方法概述
• 4.1 传统的鉴定方法
• 4.2 DNA分子标记用于物种鉴定
• 4.3 扇贝的物种鉴定
• 本研究的目的和意义
• 第二章 四种扇贝微卫星标记的筛选
• 第一节 栉孔扇贝微卫星标记的筛选
• 1 实验材料
• 1.1 材料
• 1.2 主要仪器
• 1.3 试剂
• 2 实验方法
• 2.1 扇贝DNA 的提取
• 2.2 微卫星序列的查找和分析
• 2.3 引物设计
• 2.4 引物的优化
• 2.5 PCR 产物的检测
• 2.6 等位形式大小的确定
• 2.7 多态性检测
• 2.8 遗传多样性分析
• 3 实验结果
• 3.1 模板DNA 的提取结果
• 3.2 GenBank－GSS 中栉孔扇贝的序列
• 3.3 引物设计与优化
• 3.4 多态性评价
• 4 讨论
• 4.1 通过fosmid 文库分析基因组中的串连重复序列
• 4.2 栉孔扇贝基因组中微卫星序列的分布特征
• 4.3 从fosmid文库及BAC文库等测序结果筛选微卫星DNA的优点
• 第二节 EST 中海湾扇贝微卫星标记的筛选
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 2.1 DNA 的提取
• 2.2 微卫星序列的查找和分析
• 2.3 引物的设计、优化和多态性检测
• 3 实验结果
• 3.1 微卫星位点检索结果和聚类分析结果
• 3.2 引物设计和优化结果
• 3.3 微卫星标记主要遗传学参数的估算
• 4 讨论
• 4.1 从EST 中筛选微卫星 DNA 的现状
• 4.2 EST 中微卫星 DNA 的含量
• 4.3 EST 中微卫星 DNA 的类型
• 第三节 富集文库的方法筛选华贵栉孔扇贝的微卫星标记
• 1 实验材料
• 1.1 材料
• 1.2 主要药品
• 2 实验方法
• 2.1 DNA 的提取
• 2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.3 富集文库的构建
• 2.4 小插入片段文库插入片段平均长度的估算
• 2.5 克隆重排
• 2.6 菌落原位杂交
• 2.7 DNA 序列的测定和分析
• 2.8 引物的设计、引物的优化和位点的多态性检测
• 3 实验结果
• 3.1 基因组 DNA 的酶切和回收
• 3.2 连接头后PCR以及洗膜后PCR
• 3.3 富集文库质量的鉴定
• 3.4 富集文库扫描
• 3.5 阳性克隆测序和序列分析
• 3.6 微卫星位点的评价
• 4 讨论
• 4.1 插入片段大小的控制和回收
• 4.2 影响筛选效率的因素
• 4.3 微卫星的重复单元类型
• 4.4 微卫星中的无效等位基因（null allele）
• 第四节 富集文库的方法筛选虾夷扇贝的微卫星标记
• 1 实验材料与方法
• 1.1 扇贝活体材料的获得和 DNA 的提取
• 1.2 富集文库的构建、菌落原位杂交、阳性克隆的测序、序列分析
• 1.3 引物的设计和微卫星位点主要遗传学参数的估算
• 2 实验结果
• 3 讨论
• 第三章 利用物种特异性微卫星标记进行扇贝的物种鉴定
• 第一节 四种扇贝特异性微卫星标记的筛选
• 1 材料和方法
• 1.1 扇贝活体材料
• 1.2 四种扇贝的标记
• 1.3 物种特异性（species-specific）微卫星标记的筛选
• 2 实验结果
• 第二节 微卫星标记的灵敏度
• 1 材料与方法
• 1.1 幼虫 DNA 的提取
• 1.2 物种特异性微卫星的灵敏度测试
• 2. 实验结果
• 第三节 扇贝闭壳肌样品和幼虫的鉴定
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 2.1 DNA 的提取和PCR 模板的准备
• 2.2 PCR 反应及PCR 产物的检测
• 3 实验结果
• 3.1 扇贝闭壳肌鉴定结果
• 3.2 幼虫的鉴定结果
• 第四节 结论与讨论
• 1 微卫星用于物种鉴定
• 2 通用性引物与物种特异性引物
• 3 无效等位基因引起的误差
• 4 利用物种特异性微卫星标记做食品和商品鉴定的优点
• 5 利用物种特异性微卫星标记鉴定扇贝幼虫的优点
• 6 DHPLC 在物种和杂种鉴定的应用
• 参考文献
• 本论文创新点
• 个人简历
• 获奖情况
• 主要学术成果
• 致谢