CD147过表达对小鼠肝癌Hepa1-6细胞生物学功能的影响

论文摘要

背景与目的侵袭和转移是恶性肿瘤最主要的生物学特性,也是肿瘤致死的重要因素。研究肿瘤转移机制对肿瘤转移的早期诊断和治疗具有重要意义。肿瘤转移的方式主要有淋巴道转移、血道转移和种植转移。肿瘤发生淋巴道转移的机制尚有待研究。研究表明,肿瘤转移不仅与机体微环境有关,还与肿瘤细胞自身特性密切相关,其中细胞表面糖蛋白的糖基化调节起重要作用。CD147分子,又名EMMPRIN,属于免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily,IGSF）的跨膜糖蛋白,是细胞膜的监视分子。CD147由2个胞外Ig结构域、1个跨膜结构域和1个胞内结构域组成。从CD147的N端起,第1个胞外Ig结构域与MMPs诱导活性及CD147自身寡聚有关;第2个胞外Ig结构域与窖蛋白Caveolin-1（Cav-1）存在相互作用。由于N-糖基化不同, CD147同时表现为高糖型CD147（HG-CD147,分子量40-66KD）和低糖型CD147（LG-CD147,分子量33KD）,但CD147糖基化与肿瘤转移的关系尚不明确。CD147主要通过诱导基质金属蛋白酶活性参与组织重构,在机体发育、生殖等多种生理过程,以及肿瘤、类风湿关节炎、溃疡等多种病理过程中发挥作用。另一方面,CD147已被证实在多种肿瘤尤其是恶性肿瘤组织中表达增加,目前CD147已在肺癌、肝癌、脑胶质瘤、食道癌、喉癌、卵巢癌、乳腺癌等癌细胞中检测出来。作为存在于肿瘤细胞表面的一种粘附分子,CD147介导肿瘤和基质之间的相互作用,诱导成纤维细胞和肿瘤细胞自身MMPs生成,加速肿瘤血管的生成,从而促进肿瘤转移。目前影响CD147水平表达活性的调节剂有糖基化、生长因子、激素和膜脱落等。其中,糖基化对CD147的诱导活性起关键性作用。本文通过克隆小鼠CD147的cDNA、构建其表达载体并将其稳定过表达于小鼠肝癌细胞Hepa1-6中,观察CD147糖型和Hepa1-6细胞生物学的变化,旨在阐明CD147的糖基化及其调节在肿瘤转移中的重要作用,为抗肿瘤转移的药物设计提供有价值的实验依据和线索。方法1.从小鼠肝癌细胞HcaF中提取总RNA,利用CD147特异性引物经RT-PCR扩增CD147cDNA11-830bp片段,克隆至PMD18-T simple vector,然后亚克隆到真核表达载体质粒pcDNA3.1上,经转化、抗生素初步筛选、限制性核酸内切酶酶切和DNA测序获得重组质粒pcDNA3.1/CD147。2.利用脂质体将重组质粒pcDNA3.1/CD147转染至小鼠肝癌细胞Hepa1-6上,空载体做对照,经G418筛选及RT-PCR和Western blot分析,获得稳定表达株。3.Western blot分析稳定过表达CD147的糖型变化,并利用体外侵袭实验观察小鼠肝癌细胞Hepa1-6细胞生物学性状的变化。结果1.利用RT-PCR从小鼠肝癌细胞HcaF总RNA中成功克隆出850bp的CD147cDNA的11-830bp片断,重组阳性克隆经酶切和测序鉴定证实目的基因已正确插入pcDNA3.1表达载体中,且与载体上的c-myc基因处于同一开放阅读框,记为pcDNA3.1/CD147。2.利用脂质体转染技术,经G418筛选,RT-PCR、Western blot分析,获得了2个稳定过表达外源CD147的Hepa1-6细胞株,记为Hepa1-6/CD147。3.CD147过表达的小鼠肝癌细胞Hepa1-6中,高糖型和低糖型CD147的表达均有增加,细胞的侵袭能力显著增强。结论CD147的过表达没有影响小鼠肝癌细胞Hepa1-6中CD147的糖基化,但是显著增强细胞的侵袭能力。

论文目录

• 一、正文
• （一） 中文摘要
• （二） 英文摘要
• （三） 前言
• （四） 第一部分 CD147cDNA 克隆载体与真核表达载体的构建
• （五） 第二部分 pCDNA3.1/CD147 稳定转染 Hepa1-6 细胞及其鉴定
• （六） 第三部分 过表达CD147 对Hepa1-6 细胞生物学功能的影响
• （七） 结论
• （八） 参考文献
• 二、文献综述
• （一） 综述
• （二） 参考文献
• 三、致谢