重症肺炎外周血单核细胞TLR2、4表达与血浆TNF-α、IL-1β、IL-8水平的相关性

论文摘要

背景重症肺炎是以细菌、病毒为主要的微生物入侵机体后引发的炎症免疫信号转导紊乱性疾患,诱导以TNF-α、IL-1β及IL-8等前炎症细胞因子过度活化,促发炎症反应,最终触发炎症细胞因子的级联反应而导致全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS）。什么原因导致炎症因子的过度表达?目前还没有很好的解释。TLRs的发现是近年来天然免疫研究的一个重大进展,已证明该受体在感染免疫中起重要作用[1]。TLR2、4在TLR家族中占有重要的位置,其发现被称为是感染性疾病免疫机制研究中的重要里程碑。TLRs识别其配体后,激活NF-ΚB等转录因子和蛋白激酶,释放炎性介质激活天然免疫;同时还使抗原呈递细胞表达协同刺激分子CD80、CD86,而最终启动后续的T细胞、B细胞介导的特异性免疫[2]。TLR2、4作为重要的炎性受体,主要分布于髓源性单核细胞表面,在临床重症肺炎患者外周血在单核细胞上表达与炎症细胞因子表达情况,尚未见报道,有待进一步研究。目的在蛋白水平上及mRNA分子水平研究重症肺炎外周血单核细胞的表达,初步探讨TLR2、4表达在重症肺炎炎性反应的作用,观察重症肺炎患者外周血单核细胞上TLR 2、4表达及血浆中TNF-α、IL-1β、IL-8水平及PSI评分的相关性。资料和方法1标本来源2008年8月一2009年05月入住广州市第一人民医院呼吸科的重症肺炎患者,均符合美国胸科学会（ATS）于2007年制定的重症肺炎诊断标准。肺炎组均符合我国社区获得性肺炎的诊断依据,健康对照组来自同期门诊健康体检者。经本人及家属知情同意后抽取外周静脉血。重症肺炎患者12例、肺炎组18例、健康组12例。各抽血11mL, EDTAK3抗凝。2方法2.1单核细胞表面TLR2、4的表达:采用全血三色免疫荧光单抗直接标记技术。取1ml EDTAK3抗凝血,每份标本分装2管,设测定管及同型对照管。用FITC、PE、APC荧光素直接标记单克隆抗体,检测单核细胞上的三个表位（TLR2、TLR4、CD14）。用BD FACSDivaTM软件进行获取与分析,使用前向散射角（FSC）及侧向散射角（SSC）确定单核细胞群,再以FSC/CD14一APC双参数设门,每管分析门内10000个细胞,CellQuest ModFitTM软件分析单核细胞中TLR2、4的阳性率。2.2单核细胞TLR2、4mRNA的相对表达2.2.1人外周血单核细胞:Ficoll-Hypaque密度梯度离心法提取重症肺炎组、肺炎组及健康人外周血标本中单个核细胞（PBMC）,用黏附法方法分离纯化单核细胞。2.2.2单核细胞TLR2、4mRNA相对定量:参照TRIzol（美国invitrogen）说明书抽提总RNA,检测所得总RNA的质量和浓度。将从重症肺炎、肺炎患者和健康对照者分离纯化的单核细胞中提取的总RNA全部反转录成cDNA。利用Power SYBR Green PCR Master Mix（ABI）定量PCR试剂盒,将TLR2、4和β-actin的阳性模板和健康对照者的cDNA同时在荧光定量PCR仪进行扩增。反应结束后,电脑Sequence Detection System将样本的扩增曲线与标准曲线对比,并结合内参自动计算出各样本的TLR2、4基因表达的拷贝数。2.3三组标本血浆中TNF-α、IL-1β、IL-8表达水平。采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定重症肺炎、肺炎组及健康组中人TNF-α、IL-1β、IL-8的表达水平。2.4统计学方法:所有实验数据均用SPSS 13.0软件分析,计量资料以均数士标准差（士S）表示,各组数据用SPSS 13.0软件分析呈正态分布,组与组之间的两两比较采用单因素方差分析,方差齐时采用LSD法;方差不齐采用Tamhane,s T2进行多重比较;、PSI评分及血浆中TNF-α、IL-1β、IL-8浓度与TLR2、TLR4之间的相关性采用Pearson相关分析,取P<0.05差异有统计学意义。结果3.1外周血单核细胞上TLR-2、4阳性率。与健康组对比,重症肺炎组、肺炎组外周血单核细胞上TLR2、4阳性率均明显升高（P<0.01）;重症肺炎组外周血单核细胞上TLR4阳性率较肺炎组明显升高（P<0.01）.但两组间TLR2阳性率无明显差异（P>0.05）。3.2外周血中单核细胞中TLR-2、4 mRNA的表达量肺炎组和重症肺炎组外周血中单核细胞上TLR2、4mRNA表达量均较健康对照组明显升高（P<0.01）;重症肺炎组外周血中单核细胞上TLR4mRNA相对表达量较肺炎组明显升高（P<0.01）;但两者组TLR2mRNA的相对表达量无明显的差异（P>0.05）。3.3重症肺炎、肺炎及健康组血浆中TNF-α、IL-1β、IL-8水平。肺炎和重症肺炎患者血浆中TNF-α、IL-1β、IL-8水平较健康组明显升高（P<0.01）,并且重症肺炎组血浆中TNF-α、IL-1β、IL-8水平较肺炎组明显升高（P<0.01）,三组间两两比较有统计学意义。3.4患者血浆中TNF-α、IL-1β、IL-8表达水平及PSI评分与TLR2、4阳性率的相关性。三组标本外周血单核细胞TLR2、4阳性率与血浆中TNF-α、IL-1β、IL-8浓度均具有正相关性,另外TLR4与PSI评分具有正相关性,决定系数R=0.517,P=0.003。结论1.重症肺炎外周血单核细胞TLR2、4mRNA表达上调引起TLR2、4蛋白表达升高。2.重症肺炎患者血浆中TNF-α、IL-1β、IL-8浓度较肺炎组、健康组明显升高,与TLR2、4均具有正相关,与外周血单核细胞TLR2、4基因表达上调存在相关。3.重症肺炎患者外周血单核细胞TLR2、4蛋白表达较健康对照组明显升高,重症肺炎组外周血单核细胞上TLR4的表达明显高于肺炎组,并且与PSI评分存在正相关,说明TLR4的表达与肺炎的严重程度密切相关。

论文目录

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