拟南芥LCU互作蛋白的筛选及鉴定

论文摘要

转录因子通过与基因组DNA之间的互作,调控下游靶基因的表达,进而在高等植物生长发育、形态建成及其对外界环境的反应中发挥重要作用。除动植物中普遍存在的转录因子家族如NF-Y等外,植物还含有特有的转录因子如TCP转录因子家族等。根据分析预测拟南芥中可能含有24个TCP成员,分为两个亚家族ClassⅠ和Ⅱ。其中对ClassⅡ亚家族的成员的研究报道较多,该亚家族成员主要通过抑制细胞的增殖在器官形成中发挥调控作用等；而有关ClassⅠ亚家族成员的研究报道相对较少,还有许多成员尚待进一步研究。前期我们实验室采用正向遗传学手段,获得了分析推测属于TCP转录因子ClassⅠ亚家族成员的一个半显性突变体lcu-D,该突变体具有叶片上卷等多种表型。为探讨LCU参与生物学功能的分子机制,本论文首先构建了野生LCU或突变lcu与GAL4 DNA结合域BD的融合诱饵蛋白BD-LCU口BD-lcu质粒,与拟南芥幼苗cDNA的GAL4系统酵母双杂交文库AD质粒共转化酵母AH109,经过初筛、复筛、测序、一对一再验证等共筛查到我们感兴趣的与LCU和lcu同时存在互作的候选蛋白11个,例如TCP14、TCP21、NF-YC1、NF-YC3等转录因子；只与lcu互作的候选蛋白2个,包括AT5G18230、AT3G60630两基因编码的蛋白；没有筛选到只与LCU互作的候选蛋白。这些结果初步表明lcu突变蛋白可能除具有LCU的功能外,还获得了正常蛋白不存在的某些特性。采用酵母双杂交系统分析了LCU/lcu与TCP ClassⅠ家族成员的互作,表明除了TCP19、20外,LCU/lcu与其它成员间存在着同源或异源二聚化互作,β-半乳糖苷酶定量分析结果表明,突变lcu蛋白与互作TCP蛋白间存在着更强的相互作用力。酵母双杂交系统分析了LCU、lcu、TCP21与NF-YC家族成员的互作,结果表明NF-YC家族的NF-YC1/3/4/9能与以上三个TCP蛋白互作；同时,LCU/lcu与NF-YC1/3在烟草细胞核中可以共定位,这为其互作提供空间上的可能。为探究TCP蛋白与NF-YC之间是否存在表达调控,我们采用定量PCR的方法检测在突变体中基因的表达,结果显示与野生型相比,lcu-D纯合突变体中NF-YC的表达上调约1倍,其中以NF-YC4升高最多达1.9倍；而nf-yc1/3/4/9单突或多重突变体中TCP7、TCP21的表达变化并不明显。为了探寻LCU与NF-Y是否存在共同调控的下游靶基因,我们检测了细胞周期相关的Cyclin基因的表达,结果表明在lcu-D纯合突变体中CYCD3；1升高至1.5倍,CYCD4；1下调0.2倍；LCU超表达或microRNA株系,TCP21 T-DNA插入突变体che-1及nf-yc349三突中两个cyclin基因均存在不同程度下调。综上,TCP蛋白LCU与NF-Y家族蛋白之间存在互作,可能通过某种路径直接或间接调控细胞周期关键基因的表达,从而参与到高等植物的生长发育过程。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1. TCP转录因子家族
• 1.1.1 TCP家族成员结构特点、分类和进化
• 1.1.2 TCP家族成员的表达调节
• 1.1.3 TCP家族成员的生物学功能
• 1.1.4 TCP家族成员调节的靶基因
• 1.2. NF-Y转录因子家族
• 1.2.1 NF-Y转录因子家族成员及其蛋白结构特点
• 1.2.2 拟南芥中NF-Y转录因子家族基因的时空表达
• 1.2.3 NF-Y转录因子家族蛋白的生物学功能
• 1.3 本研究意义
• 2. 实验材料、药品试剂及仪器
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验药品及试剂
• 2.3 仪器
• 3. 实验方法
• 3.1 拟南芥的种植
• 3.2 DNA的提取
• 3.3 RNA的提取、反转录、Real-time定量PCR
• 3.4 烟草叶片瞬时转化及荧光显微观察
• 3.5 T-DNA插入突变体鉴定及遗传杂交
• 3.6 酵母菌感受态的制备及转化
• 3.7 酵母质粒提取、转化大肠杆菌及DNA序列测定
• 3.8 酵母四缺生长及β-半乳糖苷酶活测定
• 4. 实验结果
• 4.1 在酵母双杂交系统中LCU、Icu蛋白无转录自激活活性
• 4.2 LCU、Icu互作蛋白的筛选及鉴定
• 4.3 LCU、Icu与TCP class Ⅰ亚家族多数成员间直接互作
• 4.4 TCP蛋白与NF-YC家族蛋白直接互作
• 4.5 NF-YC1、NF-YC3与LCU、Icu共定位到细胞核
• 4.6 突变体中基因表达变化
• 4.7 双突及多突的鉴定和表型观察
• 5. 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 个人简历
• 致谢