芽殖酵母Def1蛋白在维持端粒稳定中的作用

论文题目: 芽殖酵母Def1蛋白在维持端粒稳定中的作用

论文类型: 博士论文

论文专业: 细胞生物学

作者: 陈勇彬

导师: 周金秋

关键词: 端粒,端粒酶,蛋白,游离端粒单链,蛋白和端粒保护

文献来源: 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）

发表年度: 2005

论文摘要: 在20 世纪80 年代初,人们对酵母的生物学机制还不是十分了解,经过生理学家,生物化学学家、显微观测学家和经典的分子遗传学家们几十年的共同努力,已经检测并发现了许多酵母的生物学现象,规划出了许多生物学调控途径,同时也发现了许多问题,甚至已经知道了其中一些的分子生物学机制。染色体DNA的复制有前导链和后随链的分别,而后随链模板DNA结束复制后其RNA引物会被降解,因此染色体末段的端粒DNA会有一段未完成复制,从而导致新合成的子链5’端的端粒DNA部分缺失并形成游离的3’端粒单链DNA,如果细胞再继续几轮复制,而又没有特殊的调节机制来弥补端粒DNA复制的缺陷,细胞的染色体会慢慢缩短从而引发细胞危机。科学家们发现,事实并非如此,细胞可以通过端粒酶,一种特殊的反转录酶来解决端粒DNA的复制缺陷,由此,一系列影响端粒功能的蛋白因子被相继鉴定得到并进行了较深入的研究。Rrm3p是其中一个蛋白因子,而Rrm3蛋白的功能缺失,导致端粒和亚端粒区DNA复制叉不能顺利地通过蛋白-DNA复合体结构,从而在一定程度上影响端粒DNA复制的正常进行,并最终导致了一定程度的端粒DNA延长。我们利用亲和免疫和蛋白质的质谱分析的方法鉴定出与Rrm3蛋白相互作用的Def1 蛋白,在我这篇论文里,我主要介绍我们实验室独立发现的新的端粒调节蛋白-Def1 蛋白的生物学功能。在DEF1 基因缺失的酵母细胞中,和野生型的细胞相比,其端粒缩短约200bp。Def1p功能缺失的酵母细胞还表现出温度敏感,即在37oC的培养条件下不能成活。现有的知识条件告诉我们,在酵母细胞缺失端粒酶的情况下,多数细胞会衰老并最终死亡,在芽殖酵母中,有5个基因对端粒酶本身的活性是必须的,他们分别是:EST1,EST2,EST3,TLC1和CDC13。但有一些细胞可以通过同源重组的办法,扩增复制Y’亚端粒区DNA或

论文目录:

1. 摘要

2. 背景

2.1 端粒及其主要功能

2.2 端粒复合体

2.3 CDC13/STN1/TEN1

2.4 酵母yKu 异源二聚体蛋白

2.5 其它端粒调节蛋白因子

2.6 端粒酶招募与DNA 保护

2.7 端粒单链DNA 的产生

2.8 端粒酶非依赖的存活细胞类型

2.9 Pif1p 解旋酶蛋白家族

2.10 寻找与Rrm3p 相互作用的蛋白

3. 实验结果

3.1.Def1p 蛋白的发现

3.2.DEF1 基因的敲除导致酵母细胞的端粒缩短

3.3.DEF1 基因缺失的细胞生长缓慢不是由于端粒缩短而引起

3.4.DEF1 与RRM3 的相互关系

3.5.DEF1 基因缺失的细胞表现温度敏感

3.6.DEF1 与端粒酶组分 EST2 或 EST3 基因的双缺失能加速细胞的衰老的速度

3.7.DEF1 在产生II 型的端粒酶非依赖的幸存细胞中的作用

3.8.Def1 蛋白的功能缺失导致端粒单链 DNA 的增长,而在 DEF1 基因缺失细胞中,其增长的端粒单链 DNA 和缩短的端粒表型都依赖于 Ex01 蛋白的存在

3.9.Def1p 与yKu70 相互结合

3.10 Def1p 与端粒 DNA 的结合和yKu70 与端粒的 DNA 结合不相互依赖

3.11 Def1p 与端粒DNA 直接相互作用

3.12 Def1 蛋白富含谷氨酰胺并可形成多聚体

4. 结论

4.1 结果小结

4.2 假设的模型

4.3 未来的工作方向

减数分裂

非同源染色体末端融合(NHEJ)

核糖体DNA 染色体外环的形成

5. 材料与方法

5.1 蛋白质的质谱分析

5.2.GST 融合蛋白的表达与纯化

5.3 鸡源(抗Def1蛋白)抗体IgY的制备与纯化

5.4 免疫共沉淀

5.5 酵母四孢子分析

5.6 用玻璃珠的方法抽取酵母基因组DNA

5.7 LiAc/ss-DNA/PEG-酵母转化

5.8 端粒长短的Southern-blot 检测

5.9 端粒的位置效应

5.10 酵母细胞的免疫荧光检测

5.11 染色质的免疫共沉淀实验

5.12 酵母细胞的生长实验

5.13 凝胶迟滞实验和凝胶过滤实验

5.14 核糖体DNA 染色体外环的检测

5.15 线性质粒修复实验

6. 参考文献

7. 发表文章目录

8. 致谢

发布时间: 2005-09-09

参考文献

[1].人骨髓间充质干细胞端粒调控机制的研究[D]. 李静远.浙江大学2006
[2].人的类RecD解旋酶Pif1通过抑制端粒酶活性调控端粒延伸[D]. 张登宏.中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）2006
[3].5’调控序列的甲基化水平及siRNA对端粒酶活性的影响[D]. 邹亚学.吉林大学2007
[4].SUN1在小鼠减数分裂中对端粒动态变化及配子发生的功能研究[D]. 丁旭.复旦大学2007
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[6].中年女性体力活动与端粒体的相关性及“万步行”干预效果的研究[D]. 王艳.北京体育大学2013
[7].侧柏古树端粒相关基因克隆及其抗逆功能研究[D]. 姚侠妹.中国林业科学研究院2017
[8].长链端粒DNA的结构研究[D]. 寇晓龙.吉林大学2016
[9].hTR基因在细胞中的表达及检测端粒酶活性方法的研究[D]. 金礼吉.大连理工大学2002
[10].植物端粒结构分析[D]. 李俊.武汉大学2010

芽殖酵母Def1蛋白在维持端粒稳定中的作用

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