荞麦蛋白酶抑制剂cDNA片段克隆、序列分析及表达载体的构建

论文摘要

蛋白酶抑制剂（Proteinase inhibitor，PI）以多种形式普遍存在于动、植物以及微生物中，它参与生物体内蛋白酶活性的调节，信号受体（signaling receptor）的相互作用，以及逆境情况（如外界损伤）下的应答等生理过程。除某些微生物可以产生抑制宿主蛋白水解酶活性的非蛋白类小分子外，生物的内源性蛋白酶抑制剂一般均为对蛋白水解酶有抑制活性的一类分子量较小的多肽或蛋白质。蛋白酶抑制剂在植物中分布甚广，在植物的贮藏器官，特别是种子和球茎中含量较高，在许多农作物如小麦、大麦、玉米、豆类、番茄和马铃薯中，其含量常常达总蛋白的1％-10％，植物叶片受机械损伤或化学处理，也会积累大量PI。到目前为止已发现四大类蛋白酶抑制剂，丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂（半胱氨酸蛋白酶抑制剂）、金属蛋白酶抑制剂和天冬氨酸蛋白酶抑制剂。在植物类蛋白酶抑制剂中研究得最普遍的是丝氨酸蛋白酶抑制剂，这些抑制剂已成为研究与蛋白质代谢相关医药及生物学的强有力的工具，尤其是由于它们在与诸如胰腺炎、肺气肿、癌症等疾病相关蛋白酶控制方面的治疗潜力，因而引起了医药界的广泛兴趣，生物化学家还用之作为模式系统来探索酶与底物的作用机理，同时也作为新型的抗虫基因工程元件展开了深入研究，并取得了一定的进展。植物种子是人类及牲畜的重要食物来源，蛋白酶抑制剂的存在，使其在营养学方面的研究同样引人入胜。迄今为止，人们已从大豆、豇豆、马铃薯、番茄、水稻等植物中提取出蛋白酶抑制剂，并测定了其中大部分植物来源的蛋白酶抑制剂基因序列。荞麦是我国一种传统的药食两用的小宗粮食作物，具有较高的营养价值和药用价值，荞麦的一个显著特征就是其蛋白质具有很高的生物活性。荞麦蛋白是荞麦中主要的生物活性成分，具有很高的营养价值，但早期人们也注意到人体对荞麦食品的消化吸收并不是很好，营养学家认为这是由于荞麦中存在一些抗营养因子（anti-nutritional factors）所致，蛋白酶抑制剂就是其中之一。关于荞麦中蛋白酶抑制剂基因水平的报道较少，除山西大学王转花等人对山西寿阳甜荞蛋白酶抑制剂基因序列有过报道外，国内未有关于荞麦蛋白酶抑制剂基因的其他报道。目前关于本实验室由乌克兰引种荞麦—吉乌一号甜荞蛋白酶抑制剂基因序列尚无报道。本研究通过检索NCBI数据库，对已报道的植物蛋白酶抑制剂氨基酸序列保守区进行分析，利用Primer version 5.0设计简并引物，同时提取荞麦第一对子叶总RNA，采用RT-PCR及RACE法，首次克隆得到吉乌一号甜荞蛋白酶抑制剂羧基端cDNA序列，命名为BPI-2（GenBank登录号为EF507857），利用DNAman软件对获得的BPI-2基因3′端cDNA序列进行分析，结果表明该片段长度为307bp，其中包括一个171bp的开放阅读框（ORE），编码57个氨基酸，同时包含一个136bp的3′端非转译区（3′UTR）。将BPI-2基因所推导的氨基酸序列在NCBI服务器上用BLAST搜索软件进行同源性基因检索，结果在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库中显示100条有同源性的序列，这些序列均为蛋白酶抑制剂序列，其中同源性较高的依次是苋属（Amaranthushypochondriacus）、南瓜属（Cucurbita）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、亚麻属（Linum）、大戟属（Euphorbiaceae）等，相应氨基酸序列的同源性在分别为50％～63％之间。据此，可推断克隆的基因片段即为吉乌一号荞麦蛋白酶抑制剂的cDNA片段。该序列与张政等人报道的山西寿阳甜荞蛋白酶抑制剂基因同源性为64％，由此表明该基因可能为荞麦属蛋白酶抑制剂家族的一个新成员。应用DNAman软件对荞麦蛋白酶抑制剂的氨基酸序列及从GenBank中获取的其他植物蛋白酶抑制剂序列进行系统进化分析，发现荞麦与苋属植物最先聚类合并，在进化上显示靠得最近，接着与百日草类群聚合，然后再与苦瓜属、接骨木属、柑橘属、茄属植物聚合，符合按照形态学进行判定的系统进化关系。在此基础上，对基因序列所编码多肽链一级和二级结构进行了分析，最后构建了该基因序列羧基端原核表达载体。综上所述，我们利用RT-PCR和3′RACE技术首次从吉乌一号甜荞第一对子叶中克隆获得荞麦蛋白酶抑制剂基因并对其基因特性、表达模式进行生物信息学分析，同时构建了该基因序列羧基端原核表达载体，为今后进一步研究荞麦功能性蛋白的分子机制及高效原核、真核表达载体的构建奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 蛋白酶抑制剂的类型
• 1.2 蛋白酶抑制剂的结构与理化性质
• 1.3 蛋白酶抑制剂的作用机理
• 1.4 蛋白酶抑制剂的生物功能
• 1.5 蛋白酶抑制剂的应用现状
• 1.6 蛋白酶抑制剂的分子生物学研究进展
• 1.7 蛋白酶抑制剂的研究现状、存在问题及研究热点
• 1.8 本研究的内容和意义
• 1.9 本研究的技术路线
• 第二章 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 菌株和克隆载体
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要溶液和培养基
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 荞麦蛋白酶抑制剂3′端cDNA序列的分离
• 2.2.2 PCR产物的回收
• 2.2.3 PCR产物的克隆
• 2.2.4 重组质粒的鉴定
• 2.2.5 重组质粒的核苷酸序列测定
• 2.2.6 生物信息学分析
• 2.2.7 BPI-2基因原核表达载体pET-BPI-2的构建
• 第三章 结果与分析
• 3.1 总RNA的提取
• 3.2 BPI-2基因3′端序列的克隆
• 3.2.1 RT-PCR结果
• 3.2.2 重组克隆载体pMD18-T-BPI-2的鉴定
• 3.3 重组克隆载体pMD-18T-BPI-2的序列测定
• 3.4 BPI-2基因的生物信息学分析
• 3.4.1 BPI-2基因的注册及序列分析
• 3.4.2 测序结果的同源性检索分析
• 3.4.3 BPI-2蛋白质基本性质分析
• 3.4.4 BPI-2蛋白质分子二级结构预测
• 3.4.5 BPI-2蛋白质分子保守序列分析
• 3.4.6 荞麦蛋白酶抑制剂cDNA推导氨基酸序列的系统进化分析
• 3.5 pET-BPI-2原核表达载体的构建
• 3.5.1 BPI-2结构基因的扩增
• 3.5.2 重组质粒pET-BPI-2的构建
• 第四章 讨论
• 5.1 总RNA提取
• 5.2 BPI-2基因序列分析及其编码蛋白的结构预测
• 5.3 表达载体构建及后续研究
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介