红树林放线菌的分离及其功能基因筛选

论文摘要

红树林是自然分布于热带、亚热带海岸潮间带的木本植物群落,是海洋向陆地的过渡带,有着丰富的微生物资源。长期生存于湿润、高盐、强酸性的特殊环境的红树林放线菌具有复杂独特的代谢途径,形成了独特的分子适应机制,具备产生新颖独特的次级代谢产物的潜能。因此研究红树林土壤样品的放线菌组成、功能基因的筛选有重大理论实践意义。本文主要对广东红树林土壤样品采取干热法和湿热法两种不同预处理方式,并采用高氏一号、改良高氏二号和腐殖酸培养基（HVA）三种选择性培养基,分别添加制霉菌素和萘啶酮酸两种抑制剂,对这些样品进行分离,共分离得到96株海洋放线菌菌株。用显微镜观察和菌落形态观察对分离到的放线菌进行初步归类,可将96株菌分为7个类群:灰褐类群、烬灰类群、淡紫灰类群、粉红孢类群、粉红紫类群、白孢类群和黄色类群。高氏一号培养基的分离效果最好,共得到46株具典型放线菌形态的菌株,占总数的47.9%,改良高氏二号培养基分离得到32株放线菌,为分离总数的33.3%,HVA培养基的分离效果最差,得到18株放线菌,而且得到的类群也是最少的。菌株经RFLP初步分型后,挑选部分菌株进行16S rDNA序列扩增分析,将序列结果提交到GenBank进行Blast比对。比对结果显示,分离到的海洋放线菌可归为3个属,多数放线菌分布在链霉菌属的27个种当中,并有1株菌为潜在链霉菌新种,1株可能为糖多孢菌属新种,1株为潜在拟诺卡氏菌属新种。对分离得到的96株海洋放线菌,分别采用K1F/M6R、A3F/A7R、Halo-FW/Halo-RV三对兼并引物进行I型聚酮合酶（PKS-I）,非核糖体肽合成酶（NRPS）和卤代酶功能基因扩增,评估其合成活性次级产物的潜力。筛选结果表明,在96株海洋放线菌中,有36株含有I型聚酮合酶功能基因,阳性率为37.5%,其中有6个PKS-I氨基酸序列同源性比GenBank数据库中的已知I型聚酮合酶序列的同源性低于70%;40株含有非核糖体肽合成酶基因,阳性率为41.7%,11株含有卤代酶基因,阳性率为11.5%;挑选具有PKS-I、NRPS或卤代酶基因的56株菌进行活性筛选,共得到21株活性菌株,活性率为38.5%。其中抑制率IR大于75%的菌株有12株,抑制率IR大于90%的菌株有5株。本论文的研究结果表明,广东红树林地区蕴藏有丰富的放线菌资源,很多菌种为聚酮类化合物、非核糖体肽类和卤化物的潜在生产菌株,功能基因筛选技术对放线菌活性次级代谢物的筛选具有重要的指导意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 放线菌和海洋放线菌
• 1.1.1 放线菌基础知识
• 1.1.2 海洋放线菌
• 1.2 海洋放线菌的分离与培养
• 1.2.1 放线菌分离样品前处理
• 1.2.2 分离培养基和抗生素
• 1.3 放线菌的分类
• 1.3.1 放线菌的分类地位及意义
• 1.3.2 放线菌的代表属
• 1.3.3 放线菌的16S rDNA 序列分析
• 1.4 红树林放线菌
• 1.5 放线菌的功能基因筛选
• 1.5.1 聚酮合酶基因筛选
• 1.5.2 非核糖体肽合成酶基因筛选
• 1.5.3 卤代酶基因筛选
• 1.6 论文研究的目的及意义
• 参考文献
• 第二章 红树林放线菌的分离与多样性分析
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 实验仪器和设备
• 2.2.2 样品
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 试剂
• 2.2.5 PCR 引物
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 放线菌的分离
• 2.3.2 放线菌的多样性分析
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 放线菌菌株的分离
• 2.4.2 放线菌的多样性分析
• 2.5 小结
• 参考文献
• 第三章 红树林放线菌的功能基因筛选
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 实验仪器和设备
• 3.2.2 试剂
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 放线菌基因组 DNA 的提取
• 3.3.2 放线菌功能基因筛选
• 3.3.3 阳性克隆的基因序列测定
• 3.3.4 目的基因序列的分析
• 3.3.5 菌株的发酵
• 3.3.6 菌株的抗肿瘤活性筛选
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 PKS-I、NRPS 和卤代酶基因扩增结
• 3.4.2 I 型聚酮合酶（PKS-I）功能基因片段扩增结果分析
• 3.4.3 非核糖体肽合成酶（NRPS）功能基因片段扩增结果
• 3.4.5 卤代酶功能基因片段扩增结果
• 3.4.6 功能基因筛选指导的次级活性代谢产物的初步研究
• 3.5 小结
• 参考文献
• 论文总结
• 研究展望
• 附录
• 致谢
• 个人简历与发表的学术论文