维生素D类似物EB1089对前列腺癌DU145细胞的作用研究

论文摘要

研究背景前列腺癌在美国是男性最常见恶性肿瘤之一,肿瘤死亡率位居第二。近年来,我国前列腺癌的检出率已呈明显上升趋势。目前,晚期雄激素非依赖型前列腺癌（AIPC）的治疗仍是一个难题,尚无理想的治疗方法。因此,研究和探索新的治疗策略,具有十分重要的临床意义。研究表明,Hedgehog（Hh）信号通路的激活与前列腺癌密切相关。人前列腺癌组织表达Hh配体及其下游靶基因Gli。Hh信号通路抑制剂cyclopamine（环杷明）能抑制前列腺癌肿瘤细胞增殖、改变其侵袭能力、抑制移植肿瘤的生长并引起消退。但cyclopamine因含量少,合成困难,副作用大,限制了其临床应用。最近研究发现维生素D也是一种Hh信号通路抑制剂,以很高的亲和力结合Smo,抑制Gli活性,且作用强于cyclopamine。前列腺癌的多药耐药（MDR）是导致其化疗失败的主要原因,肿瘤细胞MDR的发生与细胞膜上过量表达的ABC转运蛋白有关,包括P-型糖蛋白（PGP）、多药耐药蛋白（MRP）、乳腺癌耐药蛋白（BCRP）等,它们可以将化疗药物泵出细胞外从而导致肿瘤细胞产生耐药性。研究表明,Hh通路抑制剂是一种有效的ABC转运蛋白抑制剂,特别是对PGP、BCRP具有很强的抑制作用。然而,维生素D可引起高血钙的副作用影响了其在抗肿瘤领域的临床应用。EB1089是一种维生素D类似物,具有更强的调节肿瘤细胞生长、分化的作用,而对血钙的影响较小。本研究旨在探讨EB1089是否作为一种Hh通路抑制剂,通过Hh信号通路途径抑制雄激素非依赖型前列腺癌DU145细胞生长,逆转其MDR。方法与结果首先采用MTT法和流式细胞技术检测EB1089对DU145细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响,并与cyclopamine作比较,同时在光镜和电镜下观察细胞形态学和超微结构变化。结果显示,EB1089可以抑制DU145细胞的增殖,差异有统计学意义,呈时间和剂量依赖关系,且抑制作用强于cyclopamine。1、10、50、100nmol/L EB1089作用DU145细胞48h后,G0/G1期细胞逐渐增多,而S期细胞逐渐减少,细胞凋亡率逐步增高。EB1089作用后,镜下可见DU145细胞典型的凋亡形态学改变：细胞体积缩小,细胞核固缩、裂解,核碎片及凋亡小体形成。其次,分别用1、10、50、100nmol/L浓度的EB1089作用DU145细胞48h后,采用Real time-PCR和Western blot方法分别检测DU145细胞Glil、cyclinD1、BCL-2、Bax mRNA和蛋白的表达变化。结果显示,EB1089作用48h后,DU145细胞Glil、cyclinD1、Bcl-2 mRNA和蛋白表达均下降,Bax mRNA和蛋白表达均上调,并呈剂量依赖关系。最后,MTT法检测EB1089和多西紫杉醇二者合用对DU145细胞增殖的作用,以及EB1089对耐多西紫杉醇DU145细胞（DU145-DR）化学敏感性的影响；并采用Real time-PCR和Western blot方法分别检测EB1089作用后DU145-DR细胞PGP/MDR1、MRP、BCRP mRNA和蛋白的表达变化,结果显示,两药联合对DU145细胞增殖的抑制作用显著高于两药单独作用；DU145-DR细胞经EB1089作用后对多西紫杉醇的敏感性增加,逆转倍数为2.87,相对逆转效率为70.8%；EB1089作用后,DU145-DR细胞PGP/MDR1、BCRP的表达水平显著下调。结论EB1089可以抑制DU145细胞增殖,抑制作用于强于cyclopamine,EB1089可以阻滞DU145细胞于G1期,诱导DU145细胞凋亡,其作用机制可能是作为一种有效的Hh信号通路抑制剂,通过抑制Hh信号通路,下调Glil,进而调节cyclinD1、Bcl-2和Bax的表达来完成。EB 1089可以提高耐多西紫杉醇DU145细胞的化学敏感性,有效逆转其耐药性,其逆转机制可能主要通过下调PGP/MDR1、BCRP的表达来实现,EB1089与多西紫杉醇合用抑制DU145细胞增殖呈协同效应。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 中英文缩略词
• 前言
• 第一部分 EB1089对前列腺癌DU145细胞生长、凋亡的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第二部分 EB1089调节DU145细胞生长、凋亡机制的研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三部分 EB1089对耐多西紫杉醇DU145细胞化学敏感性的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 综述一 维生素D与前列腺癌
• 参考文献
• 综述二 Hedgehog信号通路及其抑制剂与前列腺癌
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士学位期间主要的研究成果