人骨肉瘤U-2 OS细胞甲氨蝶呤（MTX）耐药株的建立及耐药机制的研究

论文摘要

目的:建立耐甲氨蝶呤（methotrexate,MTX）的人骨肉瘤U-2 OS细胞亚系,探究还原性叶酸载体（reduced folate carrier,RFC）、二氢叶酸还原酶（dihydrofolatereductase,DHFR）基因表达与MTX耐药的关系。方法:采用大剂量冲击与逐步增加剂量相结合的方法,对人骨肉瘤细胞株U-2 OS进行诱导培养,建立4株耐药细胞株U-2 OS/R1～U-2 OS/R4。MTT法测定各细胞亚系对MTX的敏感性;半定量RT-PCR方法检测各亚系还原性叶酸载体（RFC）、二氢叶酸还原酶（DHFR）mRNA的表达。结果:本实验成功建立了4株MTX耐药细胞亚系U-2 OS/R1～U-2 OS/R4,MTT显示各亚系的耐药性逐渐增加,与其亲代细胞相比耐药指数RF分别为4、23、71、142倍。随体外U-2 OS/R1～4细胞耐药性增加,RFC基因表达逐渐减少,U-2 OS/R1～R4细胞分别为原代U-2 OS细胞的72%、66%、64%、58%（P均＜0.05）;DHFR mRNA表达逐渐增强,DHFR mRNA表达水平在U-2 OS/R1～4细胞分别为原代U-2 OS细胞的3.5、6.2、18.0、31.2倍（p均＜0.05）。结论:还原性叶酸载体（RFC）、二氢叶酸还原酶（DHFR）mRNA共同参与了U-2 OS骨肉瘤细胞MTX耐药,MTX耐药与RFC基因mRNA表达降低及DHFR基因mRNA表达增加相关。这种现象可能存在于临床的骨肉瘤病人,因而在诊断时测定RFC、DHFR基因状态将有助于筛选MTX耐药病人;而且这些耐药细胞亚系为进一步研究骨肉瘤MTX耐药及逆转提供了一种新的模型。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 人骨肉瘤U-2 OS细胞MTX耐药株的建立及其生物学性状
• 一、材料
• 1.细胞株
• 2.实验试剂和仪器
• 二、方法
• 1.细胞培养液的配制
• 2.人骨肉瘤U-2 OS细胞的培养
• 3.U-2 OS耐MTX细胞亚系的诱导建立
• 3.1 氨甲蝶呤诱导浓度的确定
• 3.2 采用大剂量冲击与逐步增加剂量相结合的方法诱导细胞耐药
• 4.各细胞亚系的生物学特性观察
• 4.1 细胞形态观察
• 4.2 细胞生长曲线和倍增时间测定
• 4.3 流式细胞仪检测细胞周期
• 5.各细胞亚系的药物敏感试验
• 5.1 MTT法药敏实验原理
• 5.2 采用MTT法检测各细胞亚系药物敏感度
• 三、结果
• 1.U-2 OS/R1～U-2 OS/R4耐药细胞株的建立
• 2.U-2 OS/R细胞的生物学特性观察
• 2.1 U-2 OS及U-2 OS/R细胞形态
• 2.2 U-2 OS细胞及各U-2 OS/R细胞亚系的生长曲线
• 2.3 流式细胞仪检测细胞周期分布结果
• 3.体外药物敏感性
• 4.U-2 OS/R1～4细胞株对MTX耐药性的稳定性
• 第二章 各耐药细胞亚系（U-2 OS/R1～U-2 OS/R4）耐药相关基因的检测
• 一、材料
• 1.实验试剂
• 2.仪器
• 二、方法
• 1.样本总RNA的提取
• 2.总RNA的浓度和纯度鉴定
• 3.RNA的完整性检查
• 4.总mRNA的反转录
• 5.目的基因RFC,DHFR mRNA的PCR扩增
• 6.PCR扩增产物凝胶电泳
• 三、结果
• 1.RFC,DHFR mRNA表达的检测结果
• 2.各细胞亚系RFC mRNA表达水平比较
• 3.各细胞亚系DHFR mRNA表达水平比较
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 攻读学位期间的研究成果
• 附录
• 致谢