论文摘要
仔猪腹泻是养猪生产中存在的普遍疾病,是影响养猪业经济效益的重要因素。肠毒素大肠杆菌（ETEC）是导致仔猪腹泻的最重要的病原菌,ETEC的致病性决定于它们在小肠上皮细胞的定居能力和产生肠毒素的能力,F4粘附素能否结合到猪的小肠上皮细胞,决定于猪小肠粘膜有无受体。无受体的猪在受到细菌感染时不发病,表现为抗性,因此,培育出抗性猪具有重要意义。所以,利用分子生物学手段寻找和筛选该受体的遗传标记是ETEC抗病育种的重要途径。本文采用微卫星和差异显示PCR方法技术,以沙子岭猪和大白猪为试验材料,对不同品种初生小猪的小肠和脾脏组织进行差异显示研究,筛选与ETEC F4黏附表型相关的候选基因和遗传标记,并通过通过荧光定量PCR对相关候选基因的表达进行了分析,主要研究结果如下。1、试验检测了63头初生仔猪小肠上皮细胞对ETEC F4三种抗原型（ab、ac、ad）的黏附表型。结果表明,F4ab型在两个猪种三种血清型的黏附比率最高,沙子岭猪黏附个体比率为0.727,大约克猪黏附个体比率为0.667:由此可见,初生仔猪患仔猪黄痢主要是大肠杆菌F4ab型与仔猪小肠上皮细胞刷状缘结合而引起的。F4ad型在两个猪种中的黏附比率差异显著,沙子岭猪的黏附个体比率为0.400,高于大约克的0.242（p＜0.05）。2、4个猪种在4个基因座均具有高度多态性,杂合度（H）在0.6117-0.7500之间,多态信息含量（PIC）达0.5749以上,最高为0.7247。中外猪种在各个微卫星座位上等位基因频率都存在显著差异,地方品种的基因多样性要比外来品种高。在微卫星座位SW458上,AC基因型在两个品种三种血清型黏附表型中均无黏附型,这为抗性猪的选择提供了可能,SW458座位可望作为E.coliF4抗性基因的遗传标记。3、通过DDRT-PCR技术,采用24对引物组合,对沙子岭猪和大白猪两个品种脾脏组织和小肠组织F4不同黏附表型进行了差异显示研究,共检测到57条差异片段。差异片段再扩增PCR中,有6条差异片段没能实现特异性扩增,本实验将其作为假阳性片段,没作进一步分析。反Northern点杂交验证,有5个差异片段表现为假阳性,试验共找到46个阳性差异片段,阳性率为80.7%（46/57）。4、本研究对22条差异表达片段进行了序列测定,经过BLAST同源性比对,发现有5条序列与已知功能基因同源性较高,其余17条序列同源性较低或者找到同源EST但是不知道该EST的功能,大部分为新的EST序列。本试验将22条EST登录到GenBank,登录号分别为FE597044-FE597057和FE861134-FE861141。5、在小肠组织中,ATPase,Ca2+ transporting,plasma membrane 1（ATP2B1）基因和Histamine receptor H1（HRH1）基因均:为93%（183/193、420/450）的同源性。ATP281即为ATP酶Ca2+转运质膜1,能调控肠道细胞的Na+和Ca2+平衡,其功能与腹泻紧密相关。同时,ATP281基因位于猪的13q31-q32,与猪小肠的F4ab受体基因紧密连锁。HRH1受体主要分布在外周组织,高表达于与炎症反应相关的组织和造血细胞中,HRH1被激动后使细胞内Ca2+增加,释放血管内皮松弛因子（EDRF）和PGI2,使小血管扩张,通透性增加。这就使肠胃的通透性增加,胃酸分泌过量,从而产生腹泻等症状。结合ATP2B、HRH1基因的同源性和功能,可分别将它们作为F4ab、F4ac受体的相候选关基因来进行下一步的研究。6、在脾脏组织中,Pre-B-cell colony enhancing factor 1（PBEF1）基因有97%（351/360）的同源性,PBEF1基因起转移糖基/烟酰胺磷酸核糖转移酶等活性作用,参与细胞信号转导、正调控细胞增殖等过程,对机体免疫、新陈代谢等有着广泛的影响,它可能是仔猪腹泻后,脾脏发生免疫应答反应而产生的产物。综合PBEF1基因的同源性和功能,可将其作为F4ad受体的相候选关基因来进行下一步的研究。7、通过荧光定量PCR技术对以上三个相关候选基因的表达分析,进一步验证了PBEF1基因可能作为仔猪腹泻的相关候选基因。ATP281基因可望作为E.coli F4ab受体的相关候选基因,而HRH1基因仍需进一步的研究。