湖羊早期妊娠诊断免疫胶体金层析试纸条的初步研制

论文摘要

在妊娠早期,母畜外周血浆中的孕酮含量远远高于发情期,所以可以通过测定血液中的孕酮含量来进行早期妊娠诊断。传统的测定方法主要有放射免疫测定法（RIA）,酶免疫测定法（EIA）和乳胶凝集测定试验（LAIT）,但是由于操作比较复杂,所以并未得到广泛的应用。胶体金免疫层析技术是20世纪90年代在免疫渗滤技术基础上建立的一种简易快速的免疫检测技术,其检测结果通过肉眼即可判断。这种技术具有操作简便,操作时间短等优点,已经广泛地应用于食品安全和激素的检测。本试验采用胶体金免疫层析技术,根据试验确立的湖羊妊娠孕酮临界值,应用竞争法研制出一种胶体金免疫层析试纸条；通过对配种后21d左右湖羊血液中的孕酮进行半定量测定,进行早期妊娠诊断,具有很好的应用价值。试验的主要内容包括以下3个部分：1.对85头配种后21 d左右未出现返情的湖羊采用放射免疫测定法（RIA）测定其外周血中的孕酮含量。研究结果表明,妊娠羊的孕酮含量为2.33±0.70ng/mL,未妊娠羊的孕酮含量为1.24±0.33ng/mL,怀孕羊的孕酮水平高于未怀孕羊,且差异显著（P<0.05）。设定孕酮含量大于1.7ng/mL为妊娠,低于1.5ng/mL为未妊娠,介于两者之间为疑似怀孕。根据上述标准,妊娠确诊率为100%,未妊娠确诊率为82.61%,疑似妊娠确诊率为64%。2.为了获得高质量的金标孕酮单抗,通过采用柠檬酸三钠还原法制备出符合要求的30 nm的胶体金溶液,在此基础上摸索胶体金标记孕酮单克隆抗体的最佳条件,并对其进行质量鉴定。用柠檬酸三钠还原法制备的30 nm胶体金溶液呈深红色,透射电镜观察,胶体金颗粒大小基本一致；胶体金标记孕酮单克隆抗体的最低稳定浓度为16μg/mL,最适稳定浓度为19.2μg/mL,最适标记pH为8.5。经电镜观察,制备的金标抗体复合物周围有一层明显的低电子密度晕圈,且其在520 nm处的OD值在0.2～0.4范围内。3.利用胶体金免疫层析技术竞争法原理,根据试验所得的湖羊早孕诊断血液孕酮临界值,用金标孕酮单抗复合物为探针制成金标垫,同时用11α-羟孕酮琥珀酸酯与BSA的偶联物和羊抗小鼠IgG二抗包被硝酸纤维素膜分别作为检测线和质控线,制备了半定量检测孕酮的胶体金免疫层析试纸条。结果采用国产SB-08玻璃纤维膜作为样品垫材料,进口Ahlstrom8964玻璃纤维膜作为金标垫,Millipore135硝酸纤维素（NC）膜作为层析材料制成试纸条。检测线和质控线上的包被浓度分别为1.6mg/mL和1.2mg/mL,金标孕酮单抗按1:2稀释后浸金法制作金标垫。NC膜划线后用3%BSA的封闭液进行封闭。试纸条的特异性、稳定性及重复性良好。临床检测27头湖羊,结果显示,与RIA法的符合率为77.8%,与生产记录进行对比后发现,用试纸条进行诊断的妊娠准确率为83.3%,未妊娠准确率为66.7%。

论文目录

• 全文摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 文献综述部分
• 第一章 羊早期妊娠诊断的方法及免疫胶体金的应用
• 1 羊早期妊娠诊断技术的研究进展
• 1.1 外部观察法
• 1.2 直肠检查法
• 1.3 阴道检查法
• 1.4 公羊试情法
• 1.5 免疫学诊断法
• 1.6 孕酮水平测定法
• 1.6.1 放射免疫测定法（RIA）
• 1.6.2 酶免疫测定法（EIA）
• 1.6.3 乳胶凝集抑制试验（LAIT）
• 1.6.4 酶联免疫吸附测定法（ELISA）
• 1.7 早孕因子诊断法（EPF）
• 1.8 血小板计数法
• 1.9 超声波诊断法
• 1.10 腹腔内窥镜检测法
• 2 免疫胶体金技术及其在临床诊断上的应用
• 2.1 免疫胶体金技术的背景
• 2.2 免疫胶体金技术的原理
• 2.3 免疫胶体金技术的特点
• 2.4 免疫胶体金技术的应用
• 2.4.1 在电镜水平的应用
• 2.4.2 在光镜水平的应用
• 2.4.3 在流式细胞仪中的应用
• 2.4.4 凝集试验
• 2.4.5 免疫印迹技术（immunoblotting）
• 2.4.6 斑点金免疫渗滤法（DIGFA）
• 2.4.7 胶体金免疫层析法（GICA）
• 2.5 胶体金免疫技术存在的问题及展望
• 试验研究部分
• 第二章 湖羊早孕诊断血样孕酮临界值的确定
• 1 材料
• 1.1 试验动物
• 1.2 主要试剂及用品
• 1.3 主要仪器及设备
• 2 方法
• 2.1 抗凝管的制备
• 2.2 试验羊的采血及处理
• 2.3 指标测定
• 2.3.1 测定原理
• 4浓度的测定'>2.3.2 P₄浓度的测定
• 2.4 数据统计及分析
• 3 结果
• 4 讨论
• 4.1 样品处理方法的影响
• 4.2 局限性分析
• 第三章 胶体金溶液及金标孕酮单克隆抗体复合物的制备
• 1 材料
• 1.1 主要仪器及设备
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要试剂配制
• 2+Mg²+PBS'>1.3.1 无Ca²+Mg²+PBS
• 1.3.2 硅化液配方
• 1.3.3 1%氯金酸配方
• 1.3.4 5%BSA
• 1.3.5 1%柠檬酸三钠
• 1.3.6 0.2mol/L碳酸钾溶液
• 2 方法
• 2.1 玻璃器皿的清洁及硅化处理
• 2.2 柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液
• 2.3 柠檬酸三钠加入量的确定
• 2.4 胶体金溶液的质量鉴定
• 2.4.1 肉眼观察
• 2.4.2 可见光光谱法
• 2.4.3 透射电镜观察
• 3B₃E₁G₁）的标记条件'>2.5 孕酮单克隆抗体（S₃B₃E₁G₁）的标记条件
• 2.5.1 胶体金标记蛋白最低稳定浓度与最适稳定量的确定
• 2.5.2 最适标记pH的确定
• 2.6 免疫胶体金复合物的制备
• 2.6.1 透析袋预处理
• 2.6.2 孕酮单克隆抗体的纯化
• 2.6.3 金标孕酮单克隆抗体复合物的制备
• 2.6.4 金标记孕酮单克隆抗体复合物的纯化
• 2.7 金标记孕酮单克隆抗体复合物的鉴定
• 2.7.1 最高吸收峰检测法
• 2.7.2 OD520nm值测定法
• 2.7.3 电镜观察
• 3 实验结果
• 3.1 胶体金质量鉴定
• 3.1.1 颜色观察
• 3.1.2 可见光光谱法
• 3.1.3 透射电镜法
• 3.2 胶体金标记孕酮单抗的最低稳定浓度、最适稳定浓度及最适pH
• 3.2.1 最低稳定浓度及最适稳定浓度的确定
• 3.2.2 最适pH值的确定
• 3.3 金标记孕酮单克隆抗体复合物的鉴定
• 4 讨论
• 4.1 胶体金制备因素分析
• 4.2 最pH值和最适蛋白标记量的重要性
• 4.3 金标复合物的稳定性
• 第四章 胶体金免疫层析试纸条的组装及检测
• 1 材料
• 1.1 主要仪器及设备
• 1.2 主要试剂
• 1.3 免疫层析材料
• 2 方法
• 2.1 样品垫的制备
• 2.1.1 样品垫材料的选择
• 2.1.2 样品垫的预处理
• 2.2 金标垫的制备
• 2.2.1 金标孕酮单抗最适稀释度的确定
• 2.2.2 金标垫的预处理
• 2.2.3 浸金法制备金标垫
• 2.2.4 金标垫的干燥方法
• 2.3 NC膜的划线
• 2.3.1 NC膜型号的选择
• 2.3.2 NC膜半抗原与二抗包被量确定
• 2.3.3 喷膜
• 2.3.4 封闭液的优化
• 2.4 试纸条的组装
• 2.5 试纸条的结果判定
• 2.6 试纸条的性能测定
• 2.6.1 重复性
• 2.6.2 特异性
• 2.6.3 稳定性
• 2.7 试纸条的初步应用
• 3 结果
• 3.1 样品垫材料的筛选
• 3.2 样品垫处理液配方
• 3.3 金标垫最佳稀释度
• 3.4 金标垫最佳处理液及最佳干燥方法
• 3.5 NC膜型号的选择
• 3.6 NC膜上半抗原与二抗的包被量
• 3.7 NC膜的封闭
• 3.8 试纸条的检测
• 3.8.1 判断标准
• 3.8.2 重复性
• 3.8.3 特异性
• 3.8.4 稳定性
• 3.9 初步应用
• 4 讨论
• 4.1 样品垫的选择及处理
• 4.2 金标垫的制作
• 4.3 NC膜上蛋白的包被
• 4.3.1 NC膜的选择
• 4.3.2 划膜环境
• 4.3.3 NC膜的蛋白包被量
• 4.3.4 封闭液的选择
• 4.4 试纸条的组装和保存
• 4.5 试纸条的特点及改进方向
• 参考文献
• 全文结论
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 致谢