人可溶性CD83基因的克隆、原核表达、纯化及其融合蛋白活性检测

论文摘要

CD83分子是一个分子量约为40–45 kDa大小的糖蛋白,属于免疫球蛋白超家族成员[1,2],其功能还不是完全清楚。CD83分子表达在成熟树突状细胞和活化的淋巴细胞表面具有激活免疫效应细胞功能[1-5]。可溶形式CD83分子（sCD83）已经被发现在正常人血清中[6-8],但是其产生的机制还不是完全清楚。有研究表明sCD83是由膜表面的的CD83分子脱落产生的[8],最新研究表明sCD83也可以从CD83基因转录体选择剪接产生[9]。同时重组的sCD83蛋白具有强大的抑制混合淋巴细胞反应（MLR）和树突状细胞（dendritic cells,DCs）介导的同种异体T细胞增殖反应作用[10]。在sCD83对C57Bl/6小鼠自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型体内作用研究时,sCD83可以预防和治疗EAE的瘫痪症状,说明sCD83具有免疫抑制作用[11]。为了解sCD83功能及作用方式,表达并得到其高纯度融合蛋白是非常重要的,所以,本试验设计表达含有6个His标签的融合蛋白6×His-sCD83,用Ni-NTA亲和层析纯化,并且检测融合蛋白体外活性。方法:利用反转录PCR（RT-PCR）方法从正常人外周血单个核细胞中获得可溶性CD83基因,克隆到表达载体pET-32a载体,构成重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达6×His融合蛋白,并经SDS-PAGE及Western blot检测和鉴定。表达产物包涵体经Ni-NTA亲和层析纯化。用混合淋巴细胞反应实验检测融合蛋白体外活性。结果:经酶切鉴定及测序证实可溶性CD83蛋白基因的原核表达载体构建正确。经SDS-PAGE及Western blot显示在相对分子质量约32 000处出现融合表达条带。融合蛋白的表达量约占菌体蛋白总量的45%。重组蛋白经Ni-NTA亲和层析进行纯化后,得到了高纯度的融合蛋白。混合淋巴细胞反应实验结果表明融合蛋白具有体外活性。结论:成功克隆人外周血单个核细胞来源的可溶性CD83基因片段,并在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达,亲和层析纯化后获得高纯度融合蛋白。融合蛋白具有体外活性。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 实验一 人可溶性CD83 基因的克隆、原核表达和纯化
• 1 材料
• 1.1 质粒和菌株
• 1.2 工具酶、主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 RT- PCR
• 2.2 重组表达载体的构建及鉴定
• 2.3 融合蛋白诱导表达条件的优化及可溶性分析
• 2.4 重组融合蛋白的纯化及其含量、纯度的测定
• 2.5 融合蛋白Western blot 检测
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二 sCD83 融合蛋白在单向混合淋巴细胞培养中对T 细胞增殖的影响
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 刺激细胞（DCs）的制备
• 2.2 反应细胞的制备
• 2.3 混合淋巴细胞反应
• 2.4 统计学处理
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢