论文摘要
研究背景:氧是我们机体重要的组成元素,氧气在能量代谢中起关键的作用。在生理条件下,肺泡上皮细胞有氧代谢过程中活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）处于一种低水平激活状态,为了降低氧损伤,机体有完善的抗氧化系统清除氧化产物。然而,过度激活ROS会破坏抗氧化系统而损伤细胞内组成,最终引起细胞死亡,组织炎症反应和损伤。湿润的支气管和肺泡上皮细胞直接接触高氧环境是最容易受氧化激活损伤。蛋白的氧化损伤和肺生理功能的丧失是高氧肺损伤的结局之一。目前的研究多数集中于探讨抗氧化酶如何减轻高氧引起的气道损伤,譬如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶或谷胱甘肽过氧化物酶等。在高氧暴露早期为了维持肺泡上皮细胞内环境的稳态,清除氧化损伤蛋白的生物途径可能充当了重要的作用。泛素-蛋白酶体途径（Ubiquitin-Proteasome Pathway,UPP）是一种高效的蛋白分解途径,是一种清除损伤或陈旧蛋白质的重要途径,广泛存在于细胞胞浆、细胞核和内质网中。该通路参与NF-κB通路的激活,研究发现NF-κB通路在高氧肺损伤病理变化中起着重要的作用。然而,泛素一蛋白酶体通路是否直接参与高氧肺损伤的病理过程,尚不清楚。在高氧肺损伤的发病过程中氧化应激与泛素蛋白酶体通路功能之间的关系尚未阐明;蛋白酶体抑制剂是否能通过抑制泛素一蛋白酶体通路,影响多种炎症介质介导的高氧肺损伤的病理生理学过程?目前,MG-132作为蛋白酶体的抑制剂,用于高氧肺损伤的研究,尚未见报导。因此,我们提出假说:如果泛素蛋白酶体通路参与高氧肺损伤的病理过程,那么抑制其活性,有可能会减少炎症因子的激活,减轻高氧导致的肺损伤。研究目的:（1）观察高氧暴露早期对肺脏的影响。（2）通过观察泛素一蛋白酶体通路是否激活,进一步观察蛋白酶体抑制剂MG-132对高氧暴露肺组织形态学和氧化激活指标的影响,探讨蛋白酶体抑制剂MG-132是否对高氧肺损伤有影响。（3）同时观察肺组织嗜中性白细胞侵润情况,以及NF-κB/炎症因子通路的变化,进一步探讨蛋白酶体抑制剂MG-132可能的作用机制。研究方法与内容:（1）建立高氧肺损伤大鼠模型。（2）实验采用完全随机设计。SD大鼠30只,分为3组,每组10只大鼠。（1）空气对照组:持续吸入空气（FiO2=0.21）72小时,于实验第1天开始腹腔内注射DMSO 0.25 ml,注射3天;（2）高氧组:持续吸入高浓度氧（FiO2＞0.95）72小时,于实验第1天开始腹腔内注射DMSO 0.25 ml,注射3天;（3）高氧+MG-132组:于实验第1天开始腹腔内注射MG-132（10mg/kg.d,溶解于DMSO0.25 ml,注射3天）,其余处理同高氧组。于实验开始后0、24、48、72小时观察大鼠心率、呼吸变化,其余指标均于72小时时检测。（3）为了评价模型我们用心电监护观察大鼠心率、呼吸变化;进行形态学观察:大体病理分级,进行肺损伤病理评分;测定肺水肿指标肺湿/干重比例。（4）测定肺匀浆丙二醛（MDA）水平、超氧化物歧化酶（SOD）活性间接反映肺组织氧化损伤和氧化应激情况。（5）免疫组织化学方法和Western blot方法检测肺组织泛素化蛋白（Ubiquitin/Ubiquitin-Conjugates）的表达,检测蛋白酶体20S的活性,评价泛素.蛋白酶体途径激活情况。（6）检测肺组织匀浆髓过氧化物酶（MPO）活性,免疫组织化学方法检测肺组织NF-κB p65表达,RT-PCR检测肺组织细胞因子TNF-α、IL-6的表达,反映肺组织NF-κB/炎症因子通路的活化情况。结果:（1）成功复制高氧肺损伤大鼠模型:（2）大鼠高氧暴露后,呼吸、心率逐渐增快（P＜0.01）,出现明显肺水肿,肺湿/干重比例增高（P＜0.01）。与高氧组比较,实验72小时时高氧+MG-132组大鼠呼吸、心率相对减慢（P＜0.05）,肺水肿减轻,肺湿/干重比例降低（P＜0.01）。（3）肉眼观察:高氧模型组3天肺组织鲜红色,饱满状,表面有点片状出血或局灶状出血,胸腔有少量积液。大体病理分级高氧组与空气组差异有显著性（P＜0.01）。光镜观察;高氧组肺泡上皮肿胀,肺泡壁肺泡壁增宽、毛细血管扩张和充血,肺泡间质和肺泡腔水肿明显,肺泡内炎性细胞增多。肺损伤病理评分结果提示损伤较空气组严重（P＜0.01）。蛋白酶体抑制剂MG-132可以减轻高氧所致肺损伤,大体病理分级与高氧组比较有显著差异（P＜0.01）,肺损伤病理评分结果也提示损伤较高氧组减轻（P＜0.01）。（4）与空气组比较,高氧组肺组织匀浆MDA水平（P＜0.01）、SOD活性（P＜0.01）增高。高氧+MG-132组肺组织匀浆MDA水平、SOD活性与高氧组比较差异无统计学意义。（5）免疫组化和Western blot结果均显示大鼠高氧暴露72小时肺组织泛素化蛋白表达增强（均P＜0.01）。蛋白酶体抑制剂MG-132增强其表达（免疫组化和Western blot P值分别为0.000,0.022）。（6）高氧组蛋白酶体20S活性较空气组明显升高（P＜0.01）。蛋白酶体抑制剂MG-132抑制其活性（P＜0.01）。（7）高氧组MPO活性、NF-κB表达均较空气组增强（均P＜0.01）,同时炎症因子TNF-α、IL-6的表达也增强（均P＜0.01）。蛋白酶体抑制剂MG-132抑制了炎症细胞的浸润,降低了MPO活性（P＜0.05）,抑制了肺组织中NF-κB的表达（P＜0.05）,下调了炎症因子TNF-α（P＜0.05）、IL-6（P＜0.05）的表达。结论:（1）高氧暴露72小时对大鼠肺脏有明显损伤,弥漫性肺泡上皮细胞、肺血管内皮细胞损伤,炎症细胞肺内浸润伴肺水肿为主要病理学改变。（2）高氧暴露早期泛素蛋白酶途径激活并参与肺损伤病理生理过程。（3）蛋白酶体抑制剂MG-132可以减轻高氧引起的肺损伤。（4）蛋白酶体抑制剂MG-132可能通过抑制NF-κB/炎性因子通路而实现保护作用。（5）泛素-蛋白酶体通路可能是防治高氧肺损伤的新靶点之一。
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