论文题目: 猪白细胞介素2（pIL-2）与猪白细胞介素6（pIL-6）的基因表达及作为疫苗佐剂的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 动物遗传育种与繁殖
作者: 严琳
导师: 陈焕春,熊远著
关键词: 猪白细胞介素,猪白细胞介素,表达,巴氏德毕赤酵母,灭活苗,核酸疫苗,佐剂
文献来源: 华中农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 由病毒、细菌等病原微生物侵染动物所引起的各种传染性疾病严重制约了各个国家和地区养殖业的健康发展,同时也对人类健康存在着巨大隐患。因此,对动物传染性疾病的防治措施研究具有重大的经济价值和社会意义。疫苗免疫是当前预防和控制传染性疾病的主要措施,但目前使用的常规疫苗并不理想,存在免疫效率低与安全性差的两大难题。因此,如何在安全剂量疫苗接种下提高动物机体的免疫力,成为当今世界疫苗开发研究的热点之一。 细胞因子是由免疫效应细胞和相关细胞产生的,具有多种生物学活性的细胞调节蛋白。它在免疫应答的产生和调节中具有重要作用,可作为新一代免疫佐剂增强疫苗的免疫效果。二十多年来,各国学者致力于细胞因子重组蛋白作为疫苗佐剂研究,取得了许多振奋人心的结果:多种细胞因子重组蛋白包括IL、IFN、TNF、GM-CSF等,均能在不同程度上增加常规疫苗,包括灭活苗、弱毒苗、亚单位疫苗等的免疫效应。近年来,将细胞因子基因作为DNA疫苗佐剂,由于其简便性与有效性,亦受到了人们愈来愈多的关注与重视。 鉴于此,本研究以猪白细胞介素2(pIL-2)与猪白细胞介素6(pIL-6)为研究对象,开展了这两种细胞因子以及他们的融合蛋白(pIL6-IL2)以重组蛋白的形式对常规疫苗PRV灭活疫苗的佐剂效应研究,及以基因形式对PRRSV ORF5核酸疫苗的佐剂效应研究。主要研究内容包括: 1.pIL-2、pIL-6及pIL6-IL2的原核表达及纯化 构建pIL-2、plL-6及pIL6-IL2原核表达载体,均在E.coli BL21(DE3)中获得高效表达。其中rpIL-2包含信号肽序列,rpIL-6不含信号肽序列,rpIL6-IL2由一段亲水性、低电荷效应的Linker连接均不含信号肽的pIL-6与pIL-2分子组成。三种原核表达产物均以包涵体形式产生,因此通过提取包涵体—SKL变性—透析复性的生化提纯步骤来获取有生物学活性的重组蛋白。另将提纯了的原核表达产物rpIL-2、rpIL-6免疫家兔制备多克隆抗体。 2.19IL-2、pIL-6及pIL6-IL2的酵母表达及纯化 构建pIL-2、pIL-6及pIL6-IL2酵母表达载体,在P.pastoris GS115菌株获得分泌型表达。对3种酵母表达产物分别进行了Western blot检测,验证为目的蛋白。通过N端糖基化分析,发现酵母表达产物rpIL-2带有约5kDa的N端糖链,rpIL-6无N端糖基化修饰,rpIL6-IL2则以有糖链、无糖链两种分子状态存在,之间相差约2kDa;采用硫酸铵沉淀—PBS盐析—PEG20000浓缩的纯化办法,除去培养基中的毒性成分。对3种重组酵母菌进行了分泌外源蛋白最佳诱导时间及菌株持续稳定表达情况分析,验证诱导培养第4、5天外源蛋白分泌量最高;只需保持一定的酵母生长浓度,重组酵母菌可持续培养,稳定表达外源蛋白。提纯的酵母表达产物冻干活
论文目录:
目录
摘要
ABSTRACT
缩略词(ABBREVIATION)
第1章 文献综述
1．1 细胞因子简介
1．2 白细胞介素介绍
1．2．1 来源
1．2．2 结构特征
1．2．3 生物学功能
1．2．4 临床应用
1．2．4．1 疫苗佐剂应用
1．2．4．2 治疗药物应用
1．2．4．3 白细胞介素拮抗剂应用
1．2．4．4 疾病诊断指标
1．3 白细胞介素2的研究进展
1．3．1 IL-2的结构特点
1．3．2 IL-2的来源
1．3．3 IL-2受体(IL-2R)研究
1．3．4 IL-2的作用机理
1．3．5 IL-2的生物学活性
1．3．5．1 诱导T淋巴细胞增殖与分化
1．3．5．2 刺激活化的B细胞增殖与分化
1．3．5．3 诱导NK、LAK细胞增殖
1．3．5．4 促进细胞分泌细胞因子
1．3．5．5 增敏反应
1．3．6 IL-2的临床应用
1．3．6．1 免疫治疗剂
1．3．6．1．1 单独应用IL-2
1．3．6．1．2 IL-2与其他细胞因子或化学药物联用
1．3．6．1．3 IL-2激发LAK或TIL细胞，进行过继免疫疗法
1．3．6．1．4 毒副作用
1．3．6．2 免疫增强剂功能
1．3．6．3 IL-2临床检测
1．3．7 IL-2基因工程研究
1．3．7．1 IL-2的重组表达
1．3．7．2 IL-2生物学活性检测
1．4 白细胞介素6的研究进展
1．4．1 IL-6的结构特点
1．4．2 IL-6的来源
1．4．3 IL-6受体(IL-6R)研究
1．4．4 IL-6的作用机理
1．4．5 IL-6的生物学活性
1．4．5．1 IL-6对B细胞的活性
1．4．5．2 IL-6对T细胞的影响
1．4．5．3 IL-6对造血细胞的作用
1．4．5．4 IL-6对肝细胞的活性
1．4．5．5 IL-6对神经细胞的活性
1．4．5．6 IL-6对肿瘤细胞的活性
1．4．6 IL-6的临床作用
1．4．6．1 IL-6对机体保护性作用
1．4．6．2 IL-6对机体杀伤性作用
1．4．7 IL-6的基因工程研究
1．4．7．1 IL-6的重组表达
1．4．7．2 IL-6生物学活性检测
1．5 IL-2与IL-6在免疫作用中的相互关系
1．6 佐剂简述
1．6．1 盐类佐剂
1．6．2 油乳佐剂
1．6．3 脂质体
1．6．4 微生物及微生物来源的佐剂
1．6．5 植物来源的佐剂
1．6．6 细胞因子佐剂
1．6．6．1 细胞因子蛋白佐剂研究
1．6．6．2 细胞因子基因佐剂研究
1．6．6．3 新型细胞因子重组基因工程疫苗
1．7 重组蛋白表达系统简述
1．7．1 大肠杆菌表达体系
1．7．2 酵母表达体系
1．7．3 昆虫细胞表达体系
1．7．4 哺乳动物细胞表达系统
1．8 PRV简述
1．8．1 PRV简介
1．8．2 PRV危害
1．8．3 PRV疫苗
1．9 PRRSV简述
1．9．1 PRRSV简介
1．9．2 PRRSV危害
1．9．3 PRRSV疫苗
第2章 研究目的与意义
第3章 材料与方法
3．1 实验材料
3．1．1 质粒与菌株
3．1．2 细胞、毒株与疫苗
3．1．3 实验动物
3．1．4 生化试剂
3．1．5 主要培养基
3．1．5．1 大肠杆菌培养基
3．1．5．2 酵母培养基
3．1．5．2．1 贮存液
3．1．5．2．2 酵母培养基
3．1．5．3 哺乳动物细胞培养基及消化液
3．1．6 缓冲液
3．1．6．1 质粒提取用缓冲液
3．1．6．1．1 重组质粒快速检验裂解液
3．1．6．1．2 标准碱裂解提取质粒缓冲液
3．1．6．2 SDS-PAGE缓冲液及染液
3．1．6．2．1 SDS-PAGE缓冲液
3．1．6．2．2 考马斯亮蓝染液
3．1．6．2．3 银染相关溶液、
3．1．6．3 Western blot缓冲液
3．1．7 E．coli感受态制备用试剂
3．1．8 Pichia pastoris感受态制备用试剂
3．1．9 ELISA缓冲液
3．1．10 其它缓冲液
3．2 实验方法
3．2．1 PCR扩增IL-2和IL-6
3．2．1．1 PCR扩增的引物序列
3．2．1．2 PCR反应体系
3．2．1．3 PCR反应条件
3．2．2 PCR产物的回收与纯化
3．2．3 PCR产物的克隆
3．2．4 大肠杆菌感受态细胞的制备
3．2．5 连接产物及质粒的转化
3．2．6 重组质粒的快速鉴定
3．2．6．1 PCR快速鉴定
3．2．6．2 快速裂解鉴定
3．2．7 质粒的制备
3．2．7．1 质粒的小量制备(碱裂解法)
3．2．7．2 质粒的大量制备(碱裂解法)
3．2．8 细胞因子原核表达
3．2．8．1 IPTG诱导表达
3．2．8．2 包涵体提取
3．2．8．2．1 重组菌可溶蛋白与不可溶蛋白(包涵体)的分离
3．2．8．2．2 包涵体的变性及复性
3．2．8．3 表达产物的浓度测定
3．2．8．4 SDS-PAGE蛋白凝胶电泳
3．2．8．4．1 蛋白凝胶电泳
3．2．8．4．2 蛋白凝胶考马斯亮蓝染色
3．2．9 细胞因子多克隆抗体的制备
3．2．9．1 免疫原的制备
3．2．9．2 免疫程序
3．2．10 细胞因子酵母表达
3．2．10．1 重组质粒转化感受态毕赤酵母(LiCl法)
3．2．10．1．1 质粒的准备(线性化)
3．2．10．1．2 感受态酵母细胞制备
3．2．10．1．3 质粒转化毕赤酵母菌
3．2．10．2 酵母重组基因组的提取(PCR模板制备)
3．2．10．2．1 酵母基因组的常规提取步骤
3．2．10．2．2 快速制备酵母质粒和基因组方法
3．2．10．2．3 简便制备酵母基因组方法
3．2．10．3 酵母阳性重组子筛选(PCR)
3．2．10．3．1 PCR检测的引物序列
3．2．10．3．2 PCR反应体系
3．2．10．3．3 PCR反应程序
3．2．10．4 重组酵母菌的诱导表达
3．2．10．5 银染
3．2．10．6 表达产物的Western blot检测
3．2．10．6．1 电转
3．2．10．6．2 染色
3．2．10．6．3 封闭
3．2．10．6．4 第一抗体和靶蛋白结合
3．2．10．6．5 二级抗体与硝酸纤维素滤膜的温育
3．2．10．6．6 加入底物显色
3．2．10．7 表达产物的N-联糖基化分析
3．2．10．8 重组菌株最佳表达时间的测定
3．2．10．9 不同批次重组菌株的表达情况检测
3．2．10．10 酵母表达产物的浓缩与纯化
3．2．10．11 酵母菌株的保存
3．2．11 重组蛋白稳定性检测
3．2．12 细胞因子真核表达
3．2．12．1 质粒转染哺乳细胞
3．2．12．2 G418抗性筛选
3．2．13 重组细胞因子生物学活性的测定
3．2．13．1 用CTLL-2细胞检测IL-2生物学活性
3．2．13．1．1 CTLL-2细胞的培养，冻存，复苏条件
3．2．13．1．2 IL-2生物学活性测定
3．2．13．2 用B9细胞检测IL-6生物学活性
3．2．13．2．1 B9细胞的培养
3．2．13．2．2 IL-6生物学活性测定
3．2．14 动物试验
3．2．14．1 重组细胞因子蛋白的免前准备
3．2．14．2 重组细胞因子蛋白对灭活苗佐剂效应猪试验免疫程序
3．2．14．3 细胞因子基因对核酸疫苗佐剂效应小鼠试验程序
3．2．15 病毒TCID_(50)的测定
3．2．16 病毒微量中和试验(固定病毒-稀释血清法)
3．2．17 ELISA检测
3．2．18 CTL检测
3．2．18．1 外周血单核细胞(PBMC)的分离
3．2．18．2 靶细胞的制备
3．2．18．3 乳酸脱氢酶(LDH)分析检测CTL效应
3．2．19 攻毒后PCR检测试验猪散毒情况
3．2．19．1 鼻拭子处理
3．2．19．2 PCR检测的引物序列
3．2．19．3 PCR反应体系
3．2．19．4 PCR反应程序
3．2．20 统计方法
第4章 结果与分析
4．1 pIL-2，pIL-6和pIL6-IL2的原核表达
4．1．1 pIL-2的原核表达
4．1．1．1 表达质粒pET-IL2的构建
4．1．1．2 rpIL-2的原核表达及包涵体提取
4．1．2 pIL-6的原核表达
4．1．2．1 PCR扩增去除信号肽的pIL-6序列
4．1．2．2 中间转移质粒SK~+-IL6的构建
4．1．2．3 表达质粒pGEX-IL6的构建
4．1．2．4 rpIL6的原核表达及包涵体提取
4．1．3 pIL6-IL2的原核表达
4．1．3．1 PCR扩增
4．1．3．2 表达质粒28a-IL6-IL2的构建
4．1．3．3 rpIL6-IL2的原核表达及包涵体提取
4．2 pIL-2，pIL-6和pIL6-IL2的毕赤酵母表达
4．2．1 pIL-2的毕赤酵母表达
4．2．1．1 表达质粒pPIC3．5K-IL2的构建
4．2．1．2 pPIC3．5K-IL2重组入酵母染色体的PCR鉴定
4．2．1．3 rpIL-2的酵母表达及Western blot分析
4．2．1．4 酵母表达产物rpIL-2的去N端糖基化分析
4．2．1．5 重组酵母菌GS115/pPIC3．5K-IL2表达情况分析
4．2．1．6 酵母表达产物rpIL-2的生物学活性鉴定
4．2．2 pIL-6的毕赤酵母表达
4．2．2．1 表达质粒pPIC9K-IL6的构建
4．2．2．2 pPIC9K-IL6重组入酵母染色体的PCR鉴定
4．2．2．3 rpIL-6的酵母表达及Western blot分析
4．2．2．4 酵母表达产物rpIL6的去N端糖基化分析
4．2．2．5 rpIL-6蛋白的浓缩与纯化
4．2．2．6 酵母表达产物rpIL-6的生物学活性鉴定
4．2．3 pIL6-IL2的毕赤酵母表达
4．2．3．1 表达质粒pPIC9K-IL6-IL2构建
4．2．3．2 pPIC9K-IL6-IL2重组入酵母染色体的PCR鉴定
4．2．3．3 rpIL6-IL2的酵母表达
4．2．3．4 酵母表达产物rpIL6-IL2的去N端糖基化分析
4．2．3．5 重组酵母菌GS115/pPIC9K-IL6-IL2表达情况分析
4．2．3．6 酵母表达产物rpIL6-IL2的Western blot分析
4．2．3．7 酵母表达产物rPIL6-IL2的生物学活性鉴定
4．2．4 原核表达产物与酵母表达产物的生物学活性比较
4．3 表达产物稳定性检测
4．4 pIL-2，pIL-6和pIL6-IL2的真核表达
4．4．1 含PRRSV ORF5基因及不同细胞因子基因的真核表达载体构建
4．4．2 细胞因子在Hela细胞中的表达
4．5 重组细胞因子蛋白对PRV灭活疫苗的佐剂效应研究
4．5．1 中和抗体水平检测
4．5．2 CTL水平检测
4．5．3 攻毒保护试验结果
4．5．3．1 临床症状
4．5．3．2 体温变化
4．5．3．3 排毒情况
4．6 细胞因子基因对PRRSV ORF5核酸疫苗的佐剂效应研究
4．6．1 中和抗体水平检测
4．6．2 ELISA检测
第5章 讨论与结论
5．1 pIL-2的表达
5．1．1 pIL-2在E．Coli中的表达及纯化
5．1．2 pIL-2在P．pastoris中的表达
5．2 pIL-6的表达
5．2．1 pIL-6在E．Coli中的表达及纯化
5．2．2 pIL-6在P．pastoris中的表达及纯化
5．3 pIL6-IL2的表达
5．3．1 融合蛋白pIL6-IL2的设计
5．3．2 融合蛋白pIL6-IL2在E．coli与P．pastoris中的表达
5．4 细胞因子重组蛋白对PRV灭活苗的佐剂效应研究
5．4．1 重组蛋白rpIL-2对PRV灭活苗免疫效力影响
5．4．2 重组蛋白rpIL-6对PRV灭活苗免疫效力影响
5．4．3 重组蛋白rpIL6-IL2对PRV灭活苗免疫效力影响
5．5 细胞因子基因对PRRSV ORF5核酸疫苗的佐剂效应研究
5．5．1 联有细胞因子基因的PRRSV ORF5核酸疫苗构建
5．5．2 细胞因子基因对PRRSV ORF5核酸疫苗的佐剂效应
5．6 结论
参考文献
致谢
附录
发布时间: 2005-12-05
参考文献
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