PMVECs的TRPCs表达变化在BLM诱导的大鼠肺纤维化中的地位和作用

论文摘要

背景特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）的发生与成纤维细胞（Fibroblast,Fb）转换为肌成纤维细胞（Myofibroblast, MFb）密切相关[1]。有关MFb的形成及来源除与肺间质中自身的Fb转分化有关外，骨髓干细胞、肺泡上皮细胞以及微血管内皮细胞（endothelial cells, ECs）亦可能是MFb的来源之一[2]，但是相关研究已经公认结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）、转化生长因子-β（transforming growth factoe,TGF-β）是导致MFb表型形成的关键细胞因子[3]。我们前期的研究发现博来霉素（bleomycin，BLM）诱导的肺纤维化大鼠血清中的CTGF、TGF-β1持续高表达，而肺微血管内皮细胞（pulmonary microvascularendothelial cells, PMVECs）可能是上述致肺纤维化细胞因子的主要来源之一[4,5]。研究证实，内皮细胞（endothelial cell,EC）的增殖和分化是细胞因子相关信号途径调控的结果，如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）等， VEGF/Flk-1（VEGFR2）信号是调控ECs增殖的主要途径[6,7]。细胞膜瞬时受体电位通道（Transient receptor potential channels，TRPCs）的激活可介导细胞钙离子内流增加，进而上调VEGF/Flk-1的活性引起内皮细胞的增殖[8]。近年来发现TRPC1和TRPC3/6/7是参与VEGF引起的ECs增殖调控的重要离子通道[9,10]，且VEGF可引起内皮细胞CTGF的表达增高[11]，但在BLM损伤的大鼠PMVECs异常高表达的CTGF是否与TRPC1和TRPC3/6/7通道表达异常有关未见报道。方法和目的本实验通过气管内注入BLM制作SD大鼠肺纤维化模型，于7d、14d后取大鼠肺组织做VG染色，证实造模成功。于各时间点取BLM及对照组大鼠周边肺组织做PMVECs的原代培养，经光镜、电镜观察以及免疫细胞荧光化学法鉴定证实PMVECs体外培养成功。应用免疫组织化学法以及免疫细胞荧光化学检测PMVECs中CTGF、α-SMA、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）的表达情况；应用激光共聚焦显微镜体外观察，TRPC通道阻滞剂2-APB及VEGF受体（Flk-1）阻滞剂SU1498作用各组PMVECs后，细胞内钙离子的变化趋势；免疫荧光染色及蛋白印记（western blot，WB）法检测各组PMVECs中TRPC1、TRPC3/6/7通道和FLK-1蛋白表达情况；且采用WB法检测体外TRPC通道阻断后PMVECs中α-SMA、PCNA和CTGF的表达情况。应用流式细胞仪以及PCNA的免疫荧光细胞化学染色测定PMVECs的生长状态，深入探讨TRPCs通道与BLM诱导的肺纤维化（pulmonary fibrosis,PF）大鼠PMVECs表型和功能改变间的关系，为PF的早期诊断和确定早期干预的细胞靶点提供实验和理论基础。结果1、光镜观察各组PMVECs形态呈典型内皮细胞的铺路石状，电镜检测出95%原代培养细胞表达W-P小体，免疫荧光化学证实培养细胞VIII因子相关抗原表达阳性，证实PMVECs原代培养成功；2、流式细胞仪周期检测证实BLM7d组内皮细胞增殖指数较正常对照组高,增殖指数为0.599，且BLM14d组G2期细胞数的百分比也增高，提示BLM损伤后的PMVECs增殖能力提高；3、免疫组织化学及免疫细胞荧光化学显示BLM组PMVECs较对照组CTGF、α-SMA和PCNA表达均明显增多；4、激光共聚焦显微镜体外观察显示TRPCs通道阻滞后BLM组较对照组PMVECs[Ca2+]i明显下降，阻滞FLK-1后[Ca2+]i亦呈明显下降；5、免疫荧光细胞化学及WB检测显示BLM7d、14d组PMVECs中TRPC1和TRPC3/6/7通道蛋白较对照组表达明显增高,且BLM7d、14d组PMVECs中FLK-1较正常组表达也明显增高；6、WB检测显示体外阻断PMVECs的TRPCs通道后BLM7d、14d组较对照组CTGF、α-SMA及PCNA蛋白表达均显著下降。结论1、BLM诱导大鼠肺纤维化导致的PMVECs转化为增殖表型并过度分泌CTGF是肺纤维化形成的另一重要原因；2、TRPCs功能紊乱在BLM大鼠PMVECs增殖分化、细胞内钙超载及VEGF/Flk-1信号激活起着关键作用。体外实验结果提示，BLM损伤所致的大鼠肺纤维化可能是TRPCs功能紊乱性疾病。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 文献回顾
• 实验一 BLM 诱导的大鼠肺纤维化 CTGF 的表达以及 PMVECS 表型和功能改变
• 0 引言
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二 TRPC 通道对 BLM 大鼠 PMVECS [CA2+]I的调节及其介导的 PMVECS 表型功能异常与 PF 的关系
• 0 引言
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验三 BLM 大鼠 PMVECS 生长周期与 PMVECS 增殖调控的关系
• 0 引言
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢