副猪嗜血杆菌体内诱导抗原的研究及真核表达文库的构建

论文摘要

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）是一种无运动性、多形态革兰氏阴性杆菌细菌,属于巴斯德氏菌成员。该菌是Glasser’s disease的致病因子,以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征。由于高发病率和死亡率,该病给全球的养猪业造成了巨大的经济损失。目前,人们对副猪嗜血杆菌的研究尚处于起步阶段,特别是分子水平的研究刚起步。本研究旨在筛选副猪嗜血杆菌的体内表达抗原,这些抗原基因有可能作为诊断、免疫及药物的新靶标。本研究选择我国流行优势菌株副猪嗜血杆菌5型地方株为研究对象,首先提取副猪嗜血杆菌（SH0165）的基因组DNA,用Sau3AⅠ酶切后回收1～5KB片段插入到原核表达载体pET 28a、pET28b和pET28c中,转化宿主菌,构建SH0165基因组表达文库。先用IPTG诱导文库表达蛋白,然后用经体外培养的SH0165菌株和大肠杆菌BL21（DE3）吸收过的猪副猪嗜血杆菌血清对该文库进行初筛和复筛,对筛选得到的阳性克隆提取质粒用T7启动子引物测序,测得的序列在网上用BLAST进行同源性比对,确定开放阅读框。本研究构建的副猪嗜血杆菌SH0165基因组表达文库,文库大小为3.0×103,文库重组质粒含有率大于80%,达到了理论要求。经过筛选、测序和同源性比对分析,本研究最终确定了6个开放阅读框（ORF）。他们分别是:磷酸甘油酸酯激酶（phosphoglycerate kinase）、3-氧酰基[酰基载体蛋白]合成酶Ⅰ（3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein]synthaseⅠ）、转铁蛋白前导序列（transferrinbinding protein precursor）和保守假设蛋白基因3个。这些蛋白的生物学意义正在鉴定之中。同时,本研究把部分酶切的副猪嗜血杆菌SH0165基因组连接到真核表达载体pcDNA3.1,成功构建了真核表达文库,为后续的研究工作奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词（ABBREVIATION）
• 第一章 文献综述
• 1 副猪嗜血杆菌研究进展
• 2 体内诱导抗原技术（IVIAT）的原理与应用进展
• 2.1 体内诱导抗原技术（IVIAT）的基本原理
• 2.2 血清探针的制备
• 2.3 病原体基因组表达文库的构建
• 2.4 表达文库免疫筛选
• 2.5 IVIAT的应用
• 2.6 IVIAT的优点与不足
• 2.7 展望
• 第二章 研究目的和意义
• 第三章 原核表达文库的构建和体内表达抗原的筛选
• 1 材料
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要试剂和材料
• 1.3 主要溶液
• 2 实验仪器设备
• 3 方法
• 3.1 细菌染色体DNA的大量制备
• 3.2 副猪嗜血杆菌基因组DNA的酶切和纯化
• 3.3 表达载体的大量提取
• 3.4 表达载体的酶切和回收
• 3.5 质粒构建
• 3.6 转化实验
• 3.7 质粒的小量提取
• 3.8 文库的大量提取
• 3.9 收集康复血清
• 3.10 处理血清
• 3.11 ELISA检测血清吸附效果
• 3.12 初筛
• 3.13 复筛
• 3.14 阳性克隆重组质粒的测序和分析
• 4 结果与分析
• 4.1 基因组酶切结果
• 4.2 文库载体的制备
• 4.3 质粒的酶切鉴定
• 4.4 文库的大量制备
• 4.5 攻毒猪抗体水平的测定
• 4.6 血清吸附效果检测
• 4.7 文库的筛选及鉴定
• 4.8 阳性克隆的测序和分析
• 5 讨论
• 第四章 副猪嗜血杆菌真核表达文库的构建
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果与分析
• 3.1 真核表达载体酶切回收
• 3.2 基因组酶切回收
• 3.3 真核文库质粒提取
• 4 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢