雏鸭感染Ⅰ型鸭肝炎病毒相关基因的筛选

论文摘要

鸭病毒性肝炎（Duck Viral Hepatitis,DVH）是由鸭肝炎病毒（Duck HepatitisVirus,DHV）引起的雏鸭的一种高度致死性的、传播迅速的病毒性传染病。该病以肝炎为主要特征,已呈世界性分布,给养鸭业带来了较大的经济损失。目前对鸭肝炎的研究主要集中在病毒基因组的测序、病毒的检测方法及防治等方面,对DVH发病机制的研究不多,对病毒感染过程中机体的应答机制,感染后引起雏鸭快速死亡的分子机制,机体细胞蛋白和病毒蛋白之间的相互作用及其意义的研究,目前未见报道。为研究鸭肝炎的发病机制,本研究对DHV感染过程中鸭的差异表达基因进行了探讨。主要研究内容如下:1雏鸭对DHV感染应答基因的筛选与鉴定通过DHV感染雏鸭,建立了实验动物模型。利用抑制性消减杂交技术成功构建了雏鸭在DHV感染过程中肝、脾、肾、脑四种混合组织的正反向消减cDNA文库。通过PCR从文库中筛选出50个阳性克隆,经序列测定共获得10个差异表达基因。它们包括基质Gla蛋白基因（MGP）、溶菌酶G、淋巴细胞抗原复合物基因（LY6E）、黏液素4、β2微球蛋白和一个未知基因等6个表达上调基因;干扰素刺激基因12（ISG12）、细胞色素c氧化酶Ⅲ、白细胞衍生的化学吸附素（LECT1）和染色体14ORF100等4个表达下调基因。这些基因的功能可以分为信号传导、抗病毒免疫、电子传递等几个方面。通过半定量RT-PCR对其中MGP、溶菌酶G、LY6E、ISG12、细胞色素c氧化酶Ⅲ、LECT1和染色体14ORF100等7个基因进行了鉴定。结果显示,这7个基因在雏鸭感染DHV过程中都是差异表达的。2 ISG12基因的原核表达及其功能的生物信息学分析根据反向消减cDNA文库中ISG12基因的核苷酸序列设计含有BamHI和XhoI酶切位点的引物,利用PCR扩增ISG12基因片段,将ISG12基因片段连接到原核表达载体pGEX-KG中,构建重组表达质粒pGEX-KG-ISG12,使其在大肠杆菌BL21（DE3）中获得表达,SDS-PAGE分析表明融合表达的蛋白分子量约为35kD。通过对其氨基酸序列进行生物信息学分析显示,该蛋白为水溶性膜蛋白,并有很强的抗原性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1 鸭病毒性肝炎发病机制的研究进展
• 1.1 DVH发病机制的研究现状
• 1.1.1 DVH引起的生化效应
• 1.1.2 病理发生及组织学变化
• 1.2 鸭肝炎病毒粒子的致病力
• 1.3 鸭肝炎病毒与细胞凋亡
• 2 动物机体的抗病毒机制
• 2.1 特异性免疫应答
• 2.2 非特异性细胞免疫
• 2.3 干扰素（IFN）
• 2.3.1 干扰素及其分类
• 2.3.2 干扰素抗病毒的分子机制
• 2.3.3 IFN刺激基因（ISG）的诱导和调控
• 2.3.4 IFN诱导ISG的途径
• 2.3.5 IFN诱导的抗病毒蛋白
• 2.3.6 病毒的免疫逃避
• 3 差异表达基因的筛选方法及其应用
• 3.1 差异表达基因的筛选方法
• 3.1.1 消减杂交法（SH）
• 3.1.2 mRNA差异显示（DD）
• 3.1.3 代表性序列差异分析（RDA）
• 3.1.4 cDNA-AFLP
• 3.1.5 基因表达系列分析（SAGE）
• 3.1.6 抑制性消减杂交（SSH）
• 3.1.7 cDNA微阵列
• 3.2 抑制性消减杂交技术在筛选疾病相关基因中的应用
• 4 本研究的目的和意义
• 第二章 雏鸭感染DHV差异表达基因的筛选及鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 主要仪器与设备
• 1.2 试剂
• 1.3 试验动物
• 1.4 病毒
• 1.5 动物模型的构建
• 1.6 试验组织样本的采集
• 1.7 组织总RNA的提取
• 1.8 mRNA的分离
• 1.9 抑制消减cDNA文库的构建
• 1.9.1 Driver和Tester cDNA的制备
• 1.9.2 消减杂交
• 1.9.3 PCR扩增
• 1.9.4 Tester cDNA的接头连接效率和消减文库的消减效率检测
• 1.9.5 消减cDNA质粒文库的构建
• 1.10 消减cDNA克隆的PCR筛选
• 1.11 阳性克隆cDNA片段测序及序列分析
• 1.12 RT-PCR检验差异表达基因
• 1.12.1 差异表达基因引物的设计与合成
• 1.12.2 鸭胚肝组织总RNA的提取
• 1.12.3 RT-PCR反应
• 2 结果与分析
• 2.1 组织总RNA的提取
• 2.2 mRNA的分离
• 2.3 Driver cDNA和Tester cDNA的制备
• 2.4 鸭对DHV感染差异表达基因消减cDNA文库的构建
• 2.5 消减cDNA文库的消减效率检测
• 2.6 消减cDNA克隆的PCR筛选
• 2.7 阳性克隆cDNA片段测序及序列分析
• 2.8 7个差异表达基因的RT-PCR检验
• 3 讨论
• 3.1 雏鸭感染DHV应答基因的筛选鉴定
• 3.1.1 MGP基因
• 3.1.2 溶菌酶G基因
• 3.1.3 Ly6E基因
• 3.1.4 ISG12基因
• 3.1.5 细胞色素c氧化酶Ⅲ
• 3.1.6 LECT1基因
• 3.1.7 染色体14开放阅读框100
• 3.2 应用SSH技术筛选雏鸭对DHV感染的应答基因
• 3.3 RT-PCR分析宿主应答基因的表达
• 4 小结
• 第三章 鸭ISG12基因的克隆及原核表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株、宿主菌
• 1.1.2 载体
• 1.1.3 酶、试剂
• 1.1.4 主要试剂的配制
• 1.1.5 生物学软件与相关的生物学网址
• 1.2 方法
• 1.2.1 带酶切位点PCR引物的设计
• 1.2.2 ISG12基因的扩增
• 1.2.3 ISG12基因的克隆
• 1.2.4 ISG12基因的生物学软件分析
• 1.2.5 重组表达质粒的构建
• 1.2.6 诱导表达
• 1.2.7 SDS-PAGE电泳
• 2 结果与分析
• 2.1 ISG12基因的扩增
• 2.2 ISG12基因的序列分析
• 2.2.1 ISG12推导的氨基酸序列分析
• 2.2.2 鸭ISG12基因的分子进化树分析
• 2.2.3 ISG12氨基酸序列的生物学软件分析
• 2.3 重组表达质粒pGEX-KG-ISG12的构建
• 2.4 鸭ISG12基因的原核表达
• 3 讨论
• 3.1 ISG12基因的发现及意义
• 3.2 ISG12基因序列及氨基酸序列分析
• 3.3 ISG12基因的原核表达
• 4 小结
• 总结
• 参考文献
• 致谢