草鱼肠道β-防御素克隆表达及抗菌活性分析

论文摘要

防御素不仅作为抵御微生物入侵的第一道屏障在肠道中发挥重要作用,而且也是一种先天免疫系统的重要组成部分。防御素是一类平均分子量为3.5～6kDa的具有广谱抗菌活性的短肽,通常由29～54个氨基酸组成,富含半胱氨酸和精氨酸,表现出较强的阳离子特性与热稳定性,是天然宿主识别微生物的基础。防御素的生物活性多样,具有广泛杀菌活性,对细菌、真菌、病毒、寄生虫等多种微生物都具有杀伤作用,还具有细胞毒性和免疫细胞有趋化功能.调节机体的免疫系统。根据斑马鱼（Danio rerio）、虹鳟（Oncorhynchus mykiss） beta-defensin-like2（defbl2） mRNA （GenBank序列号NM001081554.1, NM001195168.1）和石斑鱼的beta-defensin gene（GenBank序列号：JN698964.1）,进行序列的多重对比,发现三个序列具有高度同源性,设计特异性引物,以草鱼肠道总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增出了160bp草鱼β-防御素的基因,对防御素基因进行克隆并对克隆载体及pET-32a载体双酶切后进行连接,构建了高效原核表达载体pET32-GBD。将重组质粒转化入大肠杆菌表达菌BL21中进行表达,SDS-PAGE电泳和Western Blot分析表明GBD重组蛋白分子量大约为22kDa,并具有抗原性。通过Ni2+亲和层析方法纯化GBD重组蛋白,蛋白纯度均在95%以上。而经肠激酶酶切以后的重组防御素只有5KD,对其抗菌活性和GBD抗菌谱进行了分析,发现其对沙门氏菌、嗜水单胞菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌、鱼害粘球菌都有明显的抑制作用。证明草鱼肠道β-防御素具有广谱抗菌活性,对革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌均有抗菌效果。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 防御素的分类和结构特征
• 1.1 动物防御素
• 1.1.1 α-防御素
• 1.1.2 β-防御素
• 1.1.3 θ-防御素
• 1.2 昆虫类防御素
• 1.3 植物类防御素
• 2 防御素的生物学活性
• 2.1 抗细菌活性
• 2.2 抗病毒活性
• 2.3 免疫学活性
• 2.4 细胞毒作用和抗肿瘤作用
• 2.5 抗真菌作用
• 3 防御素的作用机理
• 3.1 防御素抗细菌的作用机理
• 3.2 防御素抗病毒的作用机理
• 4 防御素的应用前景
• 4.1 防御素在医学中的应用
• 4.1.1 防御素治疗肺部疾病
• 4.1.2 防御素治疗黏膜疾病
• 4.2 防御素的临床药用研究
• 4.3 防御素在畜牧业中的应用
• 第二章 草鱼肠道β-防御素的分子克隆与重组载体的构建
• 1 实验材料与设备
• 1.1 实验动物、菌种及质粒
• 1.2 主要设备与仪器
• 1.3 试剂与试剂盒
• 1.4 接头与引物
• 2 实验方法
• 2.1 动物材料处理
• 2.2 总RNA的提取
• 2.3 RNA含量和纯度的检测
• 2.4 草鱼肠道β-防御素的RT-PCR
• 2.5 草鱼肠道β-防御素基因PCR扩增
• 2.6 DNA核酸电泳检测
• 2.7 PCR产物的提纯
• 2法制备感受态细胞'>2.8 CaCl₂法制备感受态细胞
• 2.9 TA克隆
• 2.10 PCR检测
• 2.11 pMG-T-GBD质粒的提取
• 2.12 DNA定量
• 2.13 pMG-T-GBD和pET32a（+）载体的双酶切
• 2.14 酶切产物的回收与纯化
• 2.15 GBD与pET32连接反应
• 2.16 重组质粒pET32-GBD的转化和蓝白斑筛选
• 2.17 重组质粒pET32-GBD的PCR鉴定
• 2.18 重组质粒pET32-GBD的提取
• 2.19 重组质粒pET32-GBD的酶切
• 2.20 重组载体pET32-GBD的测序鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 草鱼肠道β-防御素RT-PCR扩增
• 3.2 克隆载体pMG-T-GBD的酶切鉴定
• 3.3 重组质粒pET32-GBD的PCR和酶切鉴定
• 4.讨论
• 第三章 草鱼肠道β-防御素的高效表达及抗菌活性分析
• 1 实验材料与设备
• 1.1 实验动物、菌种
• 1.2 主要设备与仪器
• 1.3 试剂与试剂盒
• 2 实验方法
• 2.1 草鱼肠道β-防御素的诱导表达
• 2.2 细菌超声破碎
• 2.3 草鱼肠道β-防御素表达蛋白的SDS-PAGE检测
• 2.4 草鱼肠道β-防御素重组蛋白的纯化
• 2.5 草鱼肠道β-防御素重组蛋白的透析
• 2.6 草鱼肠道β-防御素多克隆抗体的制备
• 2.7 草鱼肠道β-防御素重组蛋白含量测定
• 2.8 草鱼肠道β-防御素重组蛋白的Western-Blot鉴定
• 2.9 重组肠激酶酶切鉴定
• 2.10 抗菌活性测定
• 2.11 抗菌谱分析
• 3 结果分析
• 3.1 草鱼肠道重组β-防御素诱导表达结果分析
• 2+-NTA柱亲和层析纯化'>3.2 草鱼肠道β-防御素重组蛋白的Ni²⁺-NTA柱亲和层析纯化
• 3.3 草鱼肠道β-防御素重组蛋白的Western-Blot结果
• 3.4 草鱼肠道β-防御素重组蛋白肠激酶酶切
• 3.5 草鱼肠道β-防御素重组蛋白抗菌活性测定
• 3.6 草鱼肠道β-防御素重组蛋白抗菌谱分析
• 4 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 主要英文缩写
• 致谢
• 作者简介