小鼠腔前卵泡体外培养的研究

论文摘要

哺乳动物卵巢含有大量处于不同发育阶段的卵母细胞，其中多数卵母细胞存在于无腔阶段的卵泡中，但大部分卵泡在无腔阶段（腔前卵泡）中闭锁、退化，没有得到相应的利用，这无疑是动物遗传和育种资源的极大浪费。因此，腔前卵泡的开发无疑是解决这一难题的有效途径。腔前卵泡的体外培养技术已取得了一定的进展，建立了多种培养体系，有其各自的优缺点，研究者一直在摸索合适的培养模型，以期找到一种能够模拟体内卵泡发育的环境条件和模式。影响腔前卵泡体外培养的因素很多，总结以前的比较完善的方法，本研究从其中几个方面进行研究，旨在摸索出一套适合小鼠腔前卵泡体外生长发育的分离培养体系和冷冻保存保存的方法。1小鼠腔前卵泡体外培养体系应该尽可能模拟自然生存条件，离开自然条件后，卵泡培养必须克服氧分压，温度和营养物质成份的问题。其中最难以解决是营养物质成份。本试验通过对现有培养基进行，影响因子的筛选克服这一难题。（a）采用将机械分离得到的腔前卵泡随机分配，在添加ITS（胰岛素，转铁蛋白和硒）和FBS（胎牛血清）的KSOMaa培养基、DMEM培养基和M199培养基中培养。体外培养的小鼠腔前卵泡在DMEM培养基组和KSOMaa培养基组的卵泡成活率显著差异M199培养基组（p<0.05），从培养第8d开始KSOMaa培养基组的卵泡成活率（89.6%）显著高于DMEM培养基组（76.5%）（p<0.05）；DMEM培养基组和KSOMaa培养基组卵泡平均直径增长量（31.54土6.56μm/d,34.96土3.79μm/d）差异不显著，但这两组增长值与M199培养基组（26.04土5.23μm/d）差异显著（p>0.05）。表明KSOMaa培养基营养物质成份适宜用于小鼠腔前卵泡体外培养。（b）在选择合适培养基之后，如何模拟腔前卵泡周围环境，试验通过采用普通培养法和胶原蛋白包埋法（3维培养法，3D）进行比较，普通培养法卵泡生长过程中发生易发生坍塌，3D培养法能够有效降低这一现象，并且提高成活率（83.7%vs66.4%）（p<0.05）,3D培养法的卵泡平均直径日增长（37.73土3.43μm/d）显著优于普通培养组（28.22土4.52μm/d）（p<0.05）。2．采用不同浓度FSH（5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL）和LH（5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL）研究其对小鼠腔前卵泡发育的影响。结果发现：添加15μg/mL FSH、10μg/mLLH组培养小鼠腔前卵泡其平均每天直径增加值（37.72土13.74μm/d）与其它各组相比，差异显著（P<0.05），其腔前卵泡体外发育成熟率51.1%也相对高于其它各组，但差异不显著（p>0.05）。3.在冷冻过程中添加冷冻保护剂可以有效的增强细胞抗低温打击的能力，提高细胞冻融后活率、质膜完整性。采用DMSO和低密度脂蛋白（LDL）两种保护剂对对小鼠腔前卵泡防止冷冻伤害的机理进行了初步探讨。采用三步平衡法的，卵泡形态正常率（74.1％）和卵母细胞形态正常率（72.9%）显著差异于一步平衡法(（48.9％，43.3％）（P<0.05）。添加LDL组的腔前卵泡经冷冻解冻后卵母细胞形态正常率（57.2%），成活率（62.7%）均显著差异于添加DMSO组（49.3%，54.8%）（P<0.05）。4.分别在小鼠腔前卵泡培养基中加入激活素A和IGF-I，结果表明：添加激活素A组和激活素A+IGF-I组的成活率（77.9%，75.5%）显著高于未添加因子冷冻对照组（57.0%）和IGF-I组（71.1%,p＜0.05）；培养14d后添加激活素A和添加IGF-I组也达到未经冷冻保存组培养至12d时卵泡平均直径。另外添加激活素A和激活素A+IGF-I组没有明显差异，且发育能赶上未经冷冻保存组，因此，添加A和激活素A+IGF-I组的发育没有明显的延迟。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 腔前卵泡的体内发育
• 1.2 影响腔前卵泡的体外分离效果的因素
• 1.2.1 动物品种和年龄
• 1.2.2 卵巢体积，发育状况和处理时间
• 1.2.3 分离方法
• 1.3 腔前卵泡体外培养
• 1.3.1 卵巢组织培养技术
• 1.3.2 生长因子和激素对人卵泡体外培养的影响
• 1.3.3 细胞外基质（ECM）对卵泡体外培养的重要性
• 1.4 卵巢组织和卵泡冷冻保存研究进展
• 1.4.1 卵巢和卵泡冷冻原理
• 1.4.2. 卵巢组织冷冻的优缺点
• 1.4.3 卵巢组织的移植
• 1.5 现状与面临的问题
• 第二章 小鼠腔前卵泡体外培养体系的建立
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验设计
• 2.1.3 试验方法
• 2.2 统计分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 不同培养基对小鼠腔前卵泡体外培养的影响
• 2.3.2 普通培养法与胶原蛋白包埋法对腔前卵泡体外培养的影响
• 2.3.3 不同浓度 FSH 对小鼠腔前卵泡体外培养的影响
• 2.3.4 不同浓度 LH 对小鼠腔前卵泡体外培养的影响
• 2.4 分析与讨论
• 2.4.1 不同培养基对腔前卵泡体外培养的影响
• 2.4.2 不同培养方法对腔前卵泡体外培养的影响
• 2.4.3 不同浓度的 FSH 和 LH 对腔前卵泡体外培养的影响
• 第三章 低密度脂蛋白和 DMSO 对腔前卵泡冷冻保存效果的研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 统计分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 不同平衡方案对腔前卵泡形态学的影响
• 3.3.2 不同冷冻保护剂冷对小鼠腔前卵泡形态学和体外发育的影响
• 3.4 讨论
• 第四章 激活素A和胰岛素样生长因子-I对冷冻保存后小鼠腔前卵泡体外培养的影响
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 腔前卵泡的分离与处理
• 4.2 统计分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 激活素A和IGF-I对腔前卵泡体外成熟的影响
• 4.3.2 激活素A和IGF-I对腔前卵泡体外发育的影响
• 4.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介