论文摘要
纤维素酶是一种复合酶,根据各酶功能不同,可分为三类：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。纤维素酶是糖苷水解酶的一种,它可以将纤维素物质水解成单糖,进而发酵产生乙醇,从而解决农业、再生能源以及环境污染等问题。此外,纤维素酶在纺织、食品、饲料和制药行业等领域均具有广泛的应用。纤维素酶在实际应用中取得的成效与预期的目标相距甚远,主要是因为纤维素酶活性不高,因此提高纤维素酶的产量,降低生产成本成为当务之急。随着对纤维素酶研究的不断深入,生物化学、分子生物学以及基因工程等多种交叉学科的快速发展,获得适合工业化生产的高比活力的纤维素酶已指日可待。为提高纤维素酶的产量,本论文根据毕赤酵母的偏爱密码子,在不改变内切葡聚糖酶氨基酸序列的前提下,利用分子生物学软件DNAstars、Rensselaer-Wadsworth Bioinformatics Center （BiC）（www.bioinfo.rpi.edu）生物学信息中心在线RNA折叠软件Mfold程序对内切葡聚糖酶基因的碱基含量、mRNA自由能△G、二级结构等生物学信息进行分析,将低频密码子替换为高频密码子,获得优化设计的基因。本课题组从成功克隆的枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶基因End（Genbank登录号：DQ782954）出发,对去掉信号肽的End基因进行生物学分析。分析表明该基因全长1413 bp,编码470个氨基酸成熟肽。其中（G+C）%含量为44.70%,密码子第三位（G+C）%碱基含量为44.40%；加上巴斯德毕赤酵母α因子信号肽后（G+C）%为44.00%,密码子第三位（G+C）%碱基含量为42.00%。对End基因mRNA分析表明,折叠后最小自由能△G=-555.40 kcal/mol。根据巴斯德毕赤酵母密码子偏爱性,去除内切葡聚糖酶基因中酵母表达低频密码子,替换为高频密码子,获得能在毕赤酵母中高效表达的内切葡聚糖酶优化基因Ends,长度为1413 bp。改造后基因Ends与End的同源率为87.90%,（G+C）%为45.00%,密码子第三位（G+C）%碱基含量为50.50%。加上巴斯德毕赤酵母α因子信号肽后（G+C）%为44.30%,密码子第三位（G+C）%碱基含量为47.10%。对Ends基因mRNA分析表明,折叠后最小自由能△G=-548.90 kcal/mol。优化设计的End基因克隆及测序后,构建了优化内切葡聚糖酶的表达载体pPIC9K-Ends,获得含重组质粒pPIC9K-Ends的大肠杆菌DH5α。用含氨苄青霉素的液体培养基过夜培养阳性大肠杆菌DH5α,收集菌体,提取并纯化回收质粒pPIC9K-Ends。质粒pPIC9K-Ends经SalⅠ线性化后,电转化酵母GS115,经MM和MD平板筛选后,同时采用酵母总DNA的PCR鉴定和酶活测定的方法,筛选出阳性转化子,实现Ends基因在酵母中的分泌表达。工程菌pPIC9k-Ends-19在优化培养后,酶活达1034.7 U,比未改造的阳性菌株（P.pastoris GS115 pPIC-End）提高了1.2倍,经G418抗性筛选,确定pPIC9k-Ends-19为单拷贝转化子。SDS-PAGE分析显示Ends基因与End基因产物的分子量都为79.82 KD。经研究表明,优化后的基因Ends与未优化的基因End在毕赤巴斯德酵母中表达产物酶学性质一致。