论文摘要
目的:研究表明,胶质细胞谷氨酸转运体亚型-1（glial glutamate transporter-1, GLT-1）在维持细胞外液谷氨酸浓度处于正常水平,从而防止其兴奋性毒性作用方面发挥重要作用。例如,在大脑中动脉闭塞局灶性脑缺血模型中,应用GLT-1反义寡核苷酸可使梗死灶的范围扩大。本室最近研究发现,在大鼠脑缺血耐受模型中,脑缺血预处理通过上调海马CA1区GLT-1的表达发挥对海马CA1区神经元的保护作用。这些结果提示,增强GLT-1的表达和功能有可能发挥脑保护作用,调制GLT-1有可能成为脑缺血疾病治疗的新位点。2005年Rothstein等报道,β-内酰胺类抗生素头孢曲松钠（Ceftriaxone, CTX）可以特异性地增强GLT-1的表达和对谷氨酸的摄取。随后,韩国学者Chu于2007年报道CTX能通过上调GLT-1的表达缩小大脑中动脉闭塞性脑梗塞的梗死灶范围。这些发现为研究CTX的抗脑缺血作用提供了有力的线索和依据。但CTX是否对全脑缺血造成的神经元损伤具有保护作用尚未见研究报道。因此,本实验观察β-内酰胺类抗生素CTX对大鼠四血管闭塞全脑缺血所致海马CA1区迟发性神经元死亡的影响,并应用免疫组化和Western blot等方法检测大鼠海马CA1区GLT-1表达的变化,为阐明CTX通过上调GLT-1的表达而发挥抗神经元缺血性损伤提供进一步的实验依据,为临床上脑血管疾病的防治研究提供新的线索和依据。方法:将100只预先凝闭双侧椎动脉的雄性Wistar大鼠（270-320 g）随机分为6组:sham组（n=15）:行全脑缺血的sham手术,即只暴露双侧颈总动脉,不阻断血流。于sham手术后1 d、3 d取材观察GLT-1表达变化,7 d取材观察海马CA1区锥体神经元迟发性死亡（DND）情况（每个时间点5只动物）。CTX对照组（n=15）:于sham术前5 d开始连续腹腔注射CTX（200 mg/kg）,每日一次,共5次;其它同sham组。全脑缺血组（n=15）:全脑缺血8 min后恢复血液再灌流,其它同sham组。CTX预防组（n=35）:于全脑缺血前5 d开始连续腹腔注射CTX,每天一次,共5次。根据CTX的剂量,进一步分为50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg 3个亚组。各组均于全脑缺血再灌注后7 d取材观察海马CA1区锥体神经元DND情况（每个亚组5只动物）;50 mg/kg亚组和200 mg/kg亚组于全脑缺血术后1 d、3 d取材观察GLT-1表达的变化。CTX治疗组（n=15）:全脑缺血8 min后恢复血液再灌流,于全脑缺血当天开始连续腹腔注射CTX 5 d,每天一次,共5次。根据CTX的剂量进一步分为50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg 3个亚组（每个亚组5只动物）,于全脑缺血再灌注后7 d取材观察海马CA1区锥体神经元DND情况。CTX预防+治疗组（n=5）:于全脑缺血前5 d开始,至全脑缺血后5 d,连续腹腔注射CTX（200 mg/kg）,每天一次,共10次;于全脑缺血再灌注后7 d取材观察海马CA1区锥体神经元DND情况。结果:1 CTX减轻全脑缺血引起的海马CA1区锥体神经元DND硫堇染色结果显示,sham组大鼠海马CA1区无锥体细胞缺失。CTX（200 mg/kg）对照组大鼠海马CA1区组织形态与sham组基本一致。全脑缺血组大鼠海马CA1区DND明显,HG显著升高,ND显著下降（P<0.05）。CTX预防组中,50 mg/kg剂量组海马CA1区组织形态与全脑缺血组基本一致;100 mg/kg剂量组海马CA1区可见少量神经元死亡;200 mg/kg剂量组海马CA1区DND不明显,与全脑缺血组相比,HG明显降低,ND明显升高（P<0.05）,表明大剂量的CTX有效地预防了全脑缺血引起的海马CA1区锥体神经元的DND。CTX治疗组（50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg）,海马CA1区出现明显的DND,表明全脑缺血后应用CTX不能减轻全脑缺血打击引起的海马CA1区锥体神经元DND。而CTX（200 mg/kg）预防+治疗组海马CA1区DND不明显,与全脑缺血组相比,HG显著降低,ND显著升高（P<0.05）。2 CTX上调全脑缺血大鼠海马CA1区GLT-1蛋白的表达GLT-1免疫组织化学检测发现,sham组大鼠海马CA1区于sham术后1 d、3 d均可见到一定量GLT-1阳性颗粒,其染色较浅。CTX（200 mg/kg）对照组于sham术后1 d、3 d可见大量GLT-1阳性颗粒广泛分布于海马CA1区,与sham组各相应时间点相比,其积分光密度、平均光密度和阳性染色面积均显著升高（P<0.05）。全脑缺血组,特别是全脑缺血3 d组在锥体细胞层及其周围可见大片的GLT-1表达缺失区域。低剂量CTX（50 mg/kg）预防组于全脑缺血后1 d、3 d与sham组各相应时间点相比,大鼠海马CA1区GLT-1表达均无明显变化。而大剂量CTX（200 mg/kg）预防组于全脑缺血后1 d、3 d可见大量GLT-1阳性颗粒广泛分布于海马CA1区,尤其在海马CA1区锥体神经元细胞层可见大量、深染的GLT-1阳性颗粒包绕锥体神经元,与sham组各相应时间点相比,其积分光密度、平均光密度和阳性染色面积均显著升高（P<0.05）。Western blot分析发现,末次手术或处理后1 d,sham组大鼠可见海马CA1区GLT-1蛋白的基础表达。CTX（200 mg/kg）对照组与sham组相比,GLT-1表达明显上调,表现为GLT-1与β-actin IOD比值的升高（P<0.05）。与sham组相比,全脑缺血组及小剂量CTX（50 mg/kg）预防组GLT-1的表达无明显变化,而大剂量CTX（200 mg/kg）预防组GLT-1表达明显上调,表现为GLT-1与β-actin IOD的比值显著升高（P<0.05）。末次手术或处理后3 d,各组GLT-1的表达与1 d时各对应组相类似。结论:1预防性给予GLT-1的特异性激动剂CTX减轻了大鼠全脑缺血引起的海马CA1区锥体神经元的DND。2预防性给予GLT-1的特异性激动剂CTX上调了全脑缺血大鼠海马CA1区GLT-1蛋白的表达。3这些结果提示,CTX可通过上调GLT-1的表达,发挥抗全脑缺血性脑损伤作用。
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标签：四血管闭塞全脑缺血模型论文; 头孢曲松钠论文; 海马论文; 谷氨酸论文; 大鼠论文;