启动子低甲基化导致NGALR在食管癌中过表达

论文摘要

NGAL基因是一重要的肿瘤相关基因,它在结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、食管癌等多种肿瘤表达上调。近来,一种特异的24p3/NGAL细胞表面受体24p3R/NGALR从鼠类的FL5.12细胞被分离出来。研究表明,NGALR mRNA在慢性髓性白血病中表达下调而在食管鳞状细胞癌中表达上调。然而NGALR的调控机制还未知。在本研究中我们展示了NGALR的表达模式并检测了该基因在食管癌及细胞系中的异常甲基化。首先,我们采用免疫组织化学技术检测了59例食管癌及其相对应的正常食管鳞状上皮石蜡包埋组织样品中NGALR基因的表达情况。免疫组化结果的定量揭示了NGALR在食管癌中的表达高于正常食管上皮具有高度统计学意义（P<0.01）。其次,采用半定量反转录PCR技术,我们检测了20例配对食管癌组织和正常组织及细胞系中NGALR mRNA水平。NGALR1和NGALR2的mRNA分别在14例15例食管癌中表达上调,NGALR1 mRNA和NGALR2 mRNA在13例中共同表达上调。NGALR mRNA在三种食管癌细胞系中表达,然而在两种食管癌细胞系和永生化食管上皮细胞系中未检测到表达。再次,我们将NGALR基因5’侧翼转录调控区不同长度片段分别克隆到pGL3-Basic质粒中,构建NGALR基因5’侧翼转录调控区系列荧光素酶报告基因表达载体,并通过转染进一步分析了它们在NGALR表达细胞EC8712和不表达细胞EC109中的活性。EC8712细胞的瞬时转染分析表明,所有的NGALR启动子均显示了良好的活性。与EC109细胞相对比, NGALR启动子在EC8712细胞中具有良好的报告基因活性。最后,我们采用甲基化特异性PCR及亚硫酸氢盐修饰基因组测序法检测了食管癌组织及细胞系中NGALR的甲基化状态。在缺乏NGALR表达的细胞系可以检测到NGALR甲基化,而在NGALR表达的细胞系则未检测到NGALR甲基化。尽管存在不同的效率,使用甲基化抑制剂5-aza-2’-deoxycytidine处理NGALR甲基化的细胞系（EC109、SHEEC和SHEE）引起NGALR重新表达。总之,我们的研究结果表明NGALR的低甲基化参与了其在食管癌中的过表达,NGALR的过表达可能参与了食管癌的发病过程。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号表（缩略语）
• 第一章 前言
• 1.1 背景
• 1.1.1 DNA 甲基化意义
• 1.1.2 DNA 甲基化与肿瘤的关系
• 1.1.3 NGAL 与疾病的关系
• 1.1.4 NGALR 的发现与肿瘤的关系
• 1.1.5 研究目的
• 1.2 本项研究课题的基金来源及相关课题情况
• 1.3 本项研究课题的研究意义
• 1.4 研究目标与研究内容
• 1.4.1 研究目标
• 1.4.2 研究内容
• 第二章 材料方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 食管癌细胞系
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 临床标本
• 2.1.4 抗体
• 2.1.5 反转录试剂
• 2.1.6 质粒和菌株
• 2.1.7 PCR 试剂、酶等
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 细胞培养
• 2.2.2 5-aza-dC 的处理
• 2.2.3 抗体与免疫组化
• 2.2.4 RNA 提取
• 2.2.5 反转录PCR
• 2.2.6 感受态细胞制备
• 2.2.7 pGLB-S2985 荧光素酶报告基因构建
• 2.2.8 嵌套缺失突变载体的构建
• 2.2.9 瞬时转染双荧光素酶报告基因质粒
• 2.2.10 双荧光素酶报告基因检测
• 2.2.11 基因组DNA 的提取
• 2.2.12 甲基化的修饰
• 2.2.13 亚硫酸氢盐修饰基因组测序法
• 2.2.14 甲基化特异性PCR
• 2.2.15 统计学分析
• 第三章 结果
• 3.1 NGALR 在食管癌中过表达
• 3.2 NGALR 在食管癌细胞系中的表达水平不同
• 3.3 NGALR 在NGALR 表达细胞系中启动子转录活性高于非表达细胞系
• 3.4 NGALR 的启动子区存在CpG 岛
• 3.5 NGALR 的CpG 岛在食管癌细胞系中的甲基化水平不同
• 3.6 NGALR 启动子在食管癌中低甲基化
• 3.7 5-aza-2’-deoxycytidine 处理后NGALR 重新表达
• 第四章 讨论
• 4.1 NGALR 的过表达与食管癌发生的关系
• 4.2 NGALR 的过表达与甲基化的关系
• 4.3 NGALR 的过表达与甲基化检测在食管癌中的意义
• 4.4 结论
• 参考文献
• 附录A
• 附录B
• 攻读硕士学位期间研究成果
• 个人简介
• 致谢