刺糖多孢菌多杀菌素合成途径的克隆与组装

论文摘要

多杀菌素（spinosyns）是由放线菌刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）发酵液中提取的无公害高效杀虫剂,生产应用前景广泛,而国内多杀菌素的研究仍处于实验室阶段,产量低且不具备工业化生产的条件；另外,多杀菌素产生菌刺糖多孢菌菌株的遗传操作非常困难,使得旨在优化多杀菌素结构以及高产育种的基因工程改造困难重重,将生物合成基因转到异源宿主进行组合生物合成及异源表达,进而开展高产育种工作成为理性的选择。多杀菌素生物合成基因簇已经克隆并测序,生物合成相关基因和合成途径已经基本研究清楚。鼠李糖和福乐糖胺是多杀菌素生物合成必需的两个脱氧糖结构单元,负责其合成的4种酶的基因（gtt、epi、gdh和kre）与多杀菌素生物合成基因簇并不在一起,而是分散分布在染色体的3个位点上。本研究采用构建基因组文库、PCR扩增等手段从刺糖多孢菌NRRL18395染色体分别克隆这4个基因,将其克隆组装在同一整合型载体上,构建得到了两个脱氧六元糖单元合成途径的表达载体。多杀菌素生物合成基因簇长达80 kb,需要采用细菌人工染色体（BAC）载体技术克隆该基因簇以便异源表达生产多杀菌素。理论上在标准的DNA连接体系中大片段的DNA与小载体DNA间更倾向于得到线性的连接产物,但线性DNA无法转化大肠杆菌,这可能是克隆大片段DNA效率低的原因之一。基于上述思考,本论文构建了新的BAC载体宿主系统,采用P1噬菌体Cre-loxP重组体系在宿主细胞内将线性DNA环化形成重组子,并用刺糖多孢菌总DNA初步验证新BAC克隆策略的可行性,为克隆完整的多杀菌素生物合成途径及其异源表达奠定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1 文献综述
• 1.1 微生物次级代谢产物及其应用
• 1.2 链霉菌生理特性及其次级代谢产物的概述
• 1.3 多杀菌素及其产生菌刺糖多孢菌
• 1.3.1 多杀菌素的产品及其应用
• 1.3.2 多杀菌素产生菌刺糖多孢菌
• 1.3.3 多杀菌素的分子结构
• 1.3.4 多杀菌素的生物合成基因簇
• 1.3.5 多杀菌素的生物合成途径
• 1.3.6 多杀菌素的作用机理及生物活性
• 1.3.7 多杀菌素类衍生物
• 1.4 本课题研究的立论依据、目的、意义
• 2 材料与方法
• 2.1 菌株
• 2.2 质粒与引物
• 2.3 培养基与生化试剂
• 2.4 放线菌菌种培养及保藏
• 2.5 大肠杆菌和刺糖多孢菌的两亲本属间接合转移
• 2.6 DNA基本操作
• 2.6.1 大肠杆菌质粒的快速检测
• 2.6.2 链霉菌总DNA的提取
• 2.6.3 酶连反应
• 2.6.4 PCR及相关技术
• 2.7 基因片段转移技术
• 2.7.1 大肠杆菌化学法制备感受态细胞
• 2.7.2 大肠杆菌高效电转化感受态细胞制备
• 2.8 原位杂交
• 2.8.1 放线菌cosmid文库构建
• 2.8.2 文库转膜
• 2.8.3 探针制备并标记
• 2.8.4 预杂交,杂交
• 2.8.5 洗膜
• 2.8.6 显色
• 2.8.7 脱色,脱探针
• 2.9 放线菌BAC文库构建
• 2.9.1 菌丝体plug制备
• 2.9.2 plugDNA部分酶切预实验
• 2.9.3 plugDNA部分酶切
• 2.9.4 DNA大片段分离
• 2.9.5 大片段DNA回收
• 2.9.6 BAC酶连电转化
• 2.9.7 BAC转化子酶切验证
• 3 结果与分析
• 3.1 刺糖多孢菌NRRL18395的遗传操作
• 3.2 刺糖多孢菌NRRL18395 cosmid文库的构建
• 3.3 鼠李糖合成相关基因的克隆及组合
• 3.3.1 PCR扩增epi、gtt及克隆
• 3.3.2 原位杂交筛选刺糖多孢菌NRRL18395 cosmid文库
• 3.3.3 鼠李糖和福乐糖胺合成途径的组装及PCR验证
• 3.4 刺糖多孢菌NRRL18395BAC文库的构建
• 3.4.1 Cre-LoxP体内环化克隆外源大片段DNA
• 3.4.2 Cre-LoxP系统克隆外源基因转化子结果
• 3.4.3 BamHⅠ作为克隆位点常规方法构建BAC文库
• 3.4.4 BAC转化克隆质粒验证
• 3.4.5 BAC载体的改造
• 4 总结与讨论
• 4.1 总结
• 4.1.1 刺糖多孢菌NRRL18395的遗传操作
• 4.1.2 多杀菌素生物合成基因簇的克隆及组合
• 4.2 讨论
• 4.3 展望
• 参考文献
• 致谢