猪肌肉组织差异表达基因BTG2及其家族基因BTG1和BTG3的分子基础研究

论文摘要

BTG2基因属于BTG/TOB基因家族的重要成员,具有抗增殖和促分化的功能,我们在前期用抑制消减杂交技术对四月龄大白猪和梅山猪肌肉组织差异表达分析中发现BTG2基因表达量在品种间有极显著差异。而BTG1和BTG3基因作为其家族基因,已有报道认为它们在肌纤维的分化和生长过程中扮演着重要角色。鉴于此,本研究采用差异表达基因策略,选择BTG2、BTG1和BTG3基因作为影响猪肌肉生长发育的候选基因,开展了阶段性和不同组织表达变化规律、基因序列、遗传变异、基因结构、多态性与性状关联等方面的研究,获得如下研究结果:1、运用实时定量PCR的方法,检测了BTG2基因在大白和梅山猪胚胎期65d、出生后3d、35d、60d、120d和180d的背最长肌cDNA中的表达情况;检测了BTG1,BTG3在通城猪和大白猪出生后3d、21d、35d、60d、90d和120d背最长肌cDNA中的表达情况。结果表明:BTG2基因在肌肉发育不同阶段的表达趋势,在大白和梅山猪中具有相似趋势,均是先上调再下调,各阶段的表达量差异达到了极显著的水平（p＜0.01）;不同的是:BTG2基因在大白猪二月龄表达量达到最高,而在梅山猪中则是四月龄。BTG1基因在大白猪6个阶段的表达量呈逐渐下调趋势（p＜0.01）,在通城猪中则是先下调再上调,然后逐渐下调（p＜0.01）;品种问比较,大白猪和通城猪3d、21d、60d、90d的表达量差异都达到了极显著的水平（p＜0.01）。BTG3基因在大白和通城猪肌肉生长发育不同阶段中的表达趋势大致相同:均是前期低表达,后期高表达,120d表达量最高;在两品种之间,除了出生后3d的表达量没有显著差异外,各阶段的表达量差异达到了显著的水平（p＜0.05）。2、用RT-PCR的方法检测了BTG2、BTG1和BTG3三个基因在成年大白猪子宫、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、脂肪组织、半腱肌和背最长肌中的表达规律。结果表明,BTG2基因在心肌、半腱肌和背最长肌中高表达,在子宫、肾脏和脾脏中中等程度表达,在肝和脂肪中低表达。BTG1和BTG3基因在子宫、肝脏和脾脏中相对高表达,在肾脏和脂肪组织中中等程度的表达,而在心肌、半腱肌和背最长肌中低表达。3、采用生物信息学分析方法和RACE等技术,以“大白猪-梅山猪”抑制消减文库中获得的差异表达序列（ESTs）为基础,获得了BTG2基因全长cDNA序列和基因组序列以及BTG1基因的部分cDNA序列。推导了猪BTG2基因的氨基酸序列,采用生物信息学的方法预测了它的结构和功能,发现BTG2基因推导氨基酸序列除具有BTG/TOB基因家族所共有的boxA和boxB保守结构域外,还含有3个蛋白激酶的磷酸化位点。4、在序列测定和比对基础上,建立了BTG2基因内含子1的Psp5Ⅱ-RFLP分型技术和BTG1基因3’非翻译区的Bsh1236Ⅰ-RFLP检测方法。对大白猪、梅山猪、二花脸猪、杜洛克猪、清平和长白猪进行的群体遗传学分析结果表明:两个SNP位点在中国地方猪种和引进猪种中的分布存在极显著的差异。利用“大白×梅山”资源家系F2群体,开展的BTG2和BTG1基因SNP与生产性状相关性研究发现:BTG2基因Psp5Ⅱ-RFLP位点的不同基因型与肥肉率、6-7肋背膘厚、平均背膘厚、胴体长存在显著相关,与臀部背膘厚和瘦肥肉比例成极显著的相关;GG基因型为增加瘦肉率和降低背膘厚的基因型。BTG1基因3’非翻译区Bsh1236Ⅰ-RFLP位点的基因型与皮率、瘦肉率、臀部背膘厚、肌内脂肪含量存在显著相关,与肌内水分和眼肌面积成极显著的相关;BTG1基因AA基因型是有利于降低背膘厚和提高瘦肉率的基因型。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 肌肉的生长发育及其影响因素
• 1.1.1 肌肉的结构与组成
• 1.1.2 肌肉的生长发育
• 1.1.3 影响肌肉生长发育的因素
• 1.1.4 猪肌肉品质特征
• 1.2 中国地方猪种与国外引进猪种生长、品质等性状的差异及研究进展
• 1.2.1 中国地方猪种与国外引进猪种生长、品质等性状的差异
• 1.2.2 中外猪种肌肉生长发育和品质差异的分子生物学研究进展
• 1.3 BTG/TOB家族研究进展与目标基因的确定
• 1.3.1 BTG/TOB家族成员的发现
• 1.3.2 BTG/TOB家族的结构和基因定位
• 1.3.3 BTG/TOB家族的生理功能
• 1.3.4 猪BTG/TOB家族的基因研究进展与目标基因的确定
• 2 研究的目的和意义
• 3 材料与方法
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 组织样品
• 3.1.2 DNA样品
• 3.1.2.1 用于基因分离和多态性检测的不同猪种DNA样品
• 3.1.2.2 用于标记性状关联分析的DNA样品
• 3.1.3 性状测定
• 3.1.4 主要仪器和设备
• 3.1.5 主要药品及试剂
• 3.1.6 缓冲液和常用试剂的配制
• 3.2 试验材料的准备
• 3.2.1 总RNA的提取及cDNA第一链和SMART cDNA的合成
• 3.2.1.1 总RNA的提取
• 3.2.1.2 cDNA第一链的合成
• 3.2.1.3 SMART cDNA的合成
• 3.2.2 猪基因组DNA的提取
• 3.2.3 基因组DNA的浓度测定和质量检测
• 3.3 试验研究方法
• 3.3.1 Real-time RT-PCR研究三个基因在不同品种、不同发育阶段骨骼肌中的表达分析
• 3.3.2 RT-PCR组织表达谱分析
• 3.3.3 猪BTG1,BTG2,BTG3基因的分离方法
• 3.3.3.1 猪EST信息的获取和整理
• 3.3.3.2 引物设计
• 3.3.3.3 PCR的扩增条件
• 3.3.3.4 RACE-PCR
• 3.3.3.5 PCR产物的回收纯化、克隆和测序
• 3.3.4 DNA序列的生物信息学分析
• 3.3.5 PCR-RFLP方法检测猪BTG1和BTG2基因的多态性
• 3.3.5.1 扩增引物
• 3.3.5.2 酶切条件
• 3.3.5.3 基因分型
• 3.3.6 多态标记与性状的关联分析方法
• 3.3.6.1 分子标记在不同猪种中的等位基因频率及基因型频率计算
• 3.3.6.2 分子标记的基因效应分析
• 4 结果
• 4.1 BTG2基因的相关研究结果
• 4.1.1 BTG2基因在大白和梅山猪胚胎和出生后不同时期肌肉中的表达
• 4.1.2 BTG2基因的组织表达谱研究结果
• 4.1.3 BTG2基因的基因组和全长cDNA的克隆与鉴定结果
• 4.1.4 BTG2基因的基因组和cDNA序列分析
• 4.1.5 猪BTG2基因的SNP检测与多态分布
• 4.1.6 Psp5Ⅱ-PCR-RFLP多态性在各猪品种中的多态分布情况
• 4.1.7 BTG2基因Psp5Ⅱ-PCR-RFLP多态性与主要生产性状的关联分析
• 4.2 BTG1基因的相关研究结果
• 4.2.1 BTG1基因在大白和通城猪出生后不同时期肌肉中的表达
• 4.2.2 BTG1基因的组织表达谱研究
• 4.2.3 BTG1部分片段扩增的结果
• 4.2.4 猪BTG1基因的SNP检测
• 4.2.5 Bsh1236I-PCR-RFLP多态性在各猪品种中的多态分布
• 4.2.6 BTG1基因Bsh1236I-PCR-RFLP多态性与主要生产性状的关联分析
• 4.3 BTG3基因的相关研究结果
• 4.3.1 BTG3基因在大白和通城猪出生后不同时期肌肉中的表达
• 4.3.2 BTG3基因的组织表达谱研究
• 5 讨论
• 5.1 关于BTG2、BTG1和BTG3基因的时间依赖性表达谱和组织差异表达谱
• 5.2 关于功能基因分离策略的选择
• 5.3 关于BTG1、BTG2基因的结构和遗传变异
• 5.4 关于BTG1、BTG2基因SNP与性状的关联
• 6 小结
• 6.1 本研究的主要结果和结论
• 6.2 本研究的特色和创新点
• 6.3 需要进一步的工作
• 参考文献
• 在读期间已发表或待发表的文章
• 致谢