shRNA沉默c-Myc基因对胶质瘤细胞增殖及VEGF表达的影响研究

论文摘要

目的:本研究采用RNA干扰技术构建c-Myc癌基因靶向的shRNA质粒,沉默人类多形性胶质母细胞瘤细胞株IN500Δ细胞中c-Myc基因的表达,探讨c-Myc癌基因在体外和体内对胶质瘤IN500Δ细胞增殖及凋亡的影响。同时检测c-Myc基因沉默对胶质瘤IN500Δ细胞中VEGF表达的影响,探讨c-Myc基因在胶质瘤中的地位及其对血管新生的调控作用,为胶质瘤基因治疗和抗血管新生治疗提供重要的实验数据。方法:1 shRNA质粒构建及细胞转染:构建以c-Myc基因为靶向的shRNA干扰质粒pCMYC,同时构建pHK质粒作为阴性对照。采用脂质体介导转染的方法,将pCMYC及pHK质粒分别转染入IN500Δ细胞中,并经G418筛选,以质粒中绿色荧光蛋白为标记建立稳定表达相应质粒的IN500Δ-pCMYC及IN500Δ-pHK细胞株。2 shRNA质粒对靶向基因沉默效应的检测:以未转染IN500Δ细胞作为空白对照,采用RT-PCR方法检测各组细胞细胞中c-Myc及VEGF mRNA水平的表达变化;采用免疫细胞化学方法检测各组细胞中c-Myc及VEGF蛋白水平的表达变化。3 pCMYC质粒对IN500Δ细胞周期及细胞凋亡的影响:采用流式细胞术检测IN500Δ、IN500Δ-pHK及IN500Δ-pCMYC三组细胞的细胞周期及细胞凋亡变化情况。4裸鼠荷瘤实验检测pCMYC质粒对细胞体内增殖的影响:将IN500Δ、IN500Δ-pHK及IN500Δ-pCMYC各组细胞分别接种至裸鼠皮下成瘤,观察成瘤率及肿瘤生长情况,绘制肿瘤体积生长曲线及重量条形图。5 pCMYC质粒对体内IN500Δ细胞c-Myc及VEGF蛋白表达的影响:采用免疫组织化学法分别检测三组移植瘤中c-Myc及VEGF蛋白的表达情况。6 pCMYC质粒对体内IN500Δ细胞凋亡的影响:采用TUNEL原位细胞凋亡法检测三组移植瘤中细胞凋亡情况。7统计学分析:使用SPSS15.0统计软件对实验数据进行统计学分析。组间计量资料比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD和SNK-T检验,计数资料比较采用非参数检验,以P<0.05表示差异有统计学意义。相关分析采用Pearson相关和Spearman等级相关,以0.4<r<0.7为中度相关,r≥0.7为高度相关。结果:1成功构建以c-Myc基因为靶向的pCMYC-shRNA质粒,并建立了稳定表达该质粒的细胞株。2 pCMYC-shRNA质粒对IN500Δ细胞中c-Myc及VEGF基因mRNA水平表达的影响:RT-PCR后电泳结果显示,IN500Δ、IN500Δ-pHK及IN500Δ-pCMYC细胞中c-Myc mRNA电泳条带的平均光密度值与GADPH各相应平均光密度值的比值分别为1.185±0.145、1.098±0.128及0.273±0.028;相应VEGF各平均光密度值与GADPH各相应平均光密度值的比值分别为1.116±0.072、1.208±0.133及0.443±0.048。单因素方差分析（One-way ANOVA）及LSD、SNK-T两两比较结果示IN500Δ-pCMYC细胞组IN500Δ细胞中c-Myc与VEGF mRNA表达降低,与IN500Δ细胞组及IN500Δ-pHK细胞组相比差异均有统计学意义（P<0.01）;IN500Δ细胞组与IN500Δ-pHK细胞组IN500Δ细胞中c-Myc与VEGF mRNA表达水平均无显著性差异（P>0.05）;Pearson相关分析示c-Myc与VEGF mRNA表达之间存在正相关（r=0.938）,为高度相关（P<0.01）。3 pCMYC-shRNA质粒对IN500Δ细胞中c-Myc及VEGF蛋白水平表达的影响:免疫细胞化学染色结果显示,IN500Δ细胞及IN500Δ-pHK细胞中c-Myc与VEGF蛋白表达水平均高,IN500Δ细胞中二者的平均阳性率分别为90.02%±3.36%和84.39%±5.84%,IN500Δ-pHK细胞中二者的平均阳性率分别为86.79%±2.22%和23.52%±3.44%,Kruskal-Wallis H检验及Mann-Whiney U检验示两组c-Myc与VEGF表达之间相比均无显著性差异（P>0.05）;IN500Δ-pCMYC细胞中c-Myc与VEGF蛋白表达水平均显著降低,细胞平均阳性率分别为24.52%±4.39%和23.52%±3.44%,与IN500Δ及IN500Δ-pHK细胞组相比有显著性差异（P<0.05）。Spearman等级相关分析示在三组细胞中c-Myc与VEGF表达之间均存在正相关,相关系数分别为0.886、0.829和0.771,各相关系数均有统计学意义（P<0.05）。4 pCMYC-shRNA质粒对IN500Δ细胞周期的影响:流式细胞术细胞周期检测结果示,IN500Δ细胞处于G1期的细胞占36.9±4.7%,处于S期的细胞数占43.2±6.1%;IN500Δ-pHK细胞组中G1期细胞占34.4±5.3%,S期细胞占50.1±7.6%;IN500Δ-pCMYC细胞中处于G1期细胞占72.9±7.5%,S期细胞占9.8±3.3%。Kruskal-Wallis H检验及Mann-Whiney U检验示IN500Δ组与IN500Δ-pHK组间细胞周期分布无显著性差异（P>0.05）,IN500Δ组及IN500Δ-pHK两组与IN500Δ-pCMYC组间比较,细胞周期分布均存在显著性差异（P<0.01）。5 pCMYC-shRNA质粒对IN500Δ细胞凋亡的影响:流式细胞术细胞凋亡检测结果示,IN500Δ组、IN500Δ-pHK组及IN500Δ-pCMYC组细胞凋亡率分别为7.13%±3.57%、10.40%±4.88%及46.51%±4.99%。Kruskal-Wallis H检验及Mann-Whiney U检验示IN500Δ组与IN500Δ-pHK组间细胞凋亡率比较差异无统计学意义（P>0.05）;IN500Δ组及IN500Δ-pHK两组与IN500Δ-pCMYC组间细胞凋亡率比较均存在显著性差异（P<0.01）。6 pCMYC-shRNA质粒对IN500Δ细胞裸鼠体内增殖的影响:裸鼠成瘤实验结果示,接种IN500Δ组和IN500Δ-pHK细胞的裸鼠成瘤率为100%,肿瘤生长速度快,取材时两组裸鼠移植瘤的平均体积分别为（563.1±40.0）mm3和（521.1±32.1）mm3,肿瘤平均质量分别为（2.10±0.53）g和（1.87±0.35）g。接种IN500Δ-pCMYC细胞的裸鼠有2只未形成肿瘤,成瘤率为66.7%,肿瘤生长缓慢,取材时肿瘤平均大小为（224.6±28.3）mm3,平均重量为（0.60±0.12）g。单因素方差分析及SNK-T检验示IN500Δ组和IN500Δ-pHK组移植瘤在体积和重量上均无显著性差异（P>0.05）,IN500Δ-pCMYC组移植瘤在体积和重量上均小于IN500Δ组和IN500Δ-pHK组,差异有显著性（P<0.01）。7 pCMYC-shRNA质粒对体内IN500Δ细胞c-Myc及VEGF蛋白表达的影响:免疫组织化学法检测移植瘤中c-Myc与VEGF表达结果示,IN500Δ组及IN500Δ-pHK组移植瘤中c-Myc与VEGF阳性表达细胞量较多,成片状分布,IN500Δ组中二者平均阳性细胞率分别为81.68%±4.22%和80.73%±3.12%,在IN500Δ-pHK组中分别为77.77%±3.54%和76.39%±5.74%;IN500Δ-pCMYC组移植瘤中c-Myc与VEGF阳性表达细胞数量显著降低,呈散在分布,平均阳性细胞率分别为28.74%±1.69%和22.99%±4.90%。Kruskal-Wallis H检验及Mann-Whiney U检验示IN500Δ-pCMYC组移植瘤中c-Myc与VEGF蛋白的表达均低于IN500Δ组及IN500Δ-pHK组,差异有统计学意义（P<0.05）,而IN500Δ组及IN500Δ-pHK组移植瘤中c-Myc与VEGF蛋白的表达均无显著性差异（P>0.05）。Spearman等级相关分析示在三组移植瘤中c-Myc与VEGF表达之间均存在正相关,相关系数分别为0.829、0.886和1.000,且各相关系数经检验均有统计学意义（P<0.05）。8 pCMYC-shRNA质粒对体内IN500Δ细胞凋亡的影响:TUNEL法检测裸鼠移植瘤细胞凋亡结果示,IN500Δ组及IN500Δ-pHK组移植瘤组织中凋亡细胞数量少,散在分布,平均凋亡指数分别为23.44%±3.58%和24.00%±2.15%,IN500Δ-pCMYC组移植瘤中凋亡细胞多,灶性分布,平均凋亡指数为76.50%±2.65%。Kruskal-Wallis H检验及Mann-Whiney U检验示IN500Δ组和IN500Δ-pHK组移植瘤内细胞凋亡率间无显著性差异（P>0.05）,IN500Δ-pCMYC组移植瘤细胞凋亡指数高于IN500Δ组和IN500Δ-pHK组,其差异有统计学意义（P<0.05）。结论:1以c-Myc基因为靶向的shRNA质粒转染IN500Δ细胞后,在体内外均能有效沉默c-Myc基因mRNA及蛋白的表达;2沉默c-Myc基因在体内外均能够有效抑制IN500Δ细胞增殖并诱导大量肿瘤细胞发生凋亡;3恶性胶质瘤细胞中VEGF的表达与c-Myc的表达之间存在一定的相关性,沉默c-Myc基因可相应降低VEGF的表达,c-Myc可能通过VEGF调节肿瘤的血管生成;4 c-Myc基因可以作为对恶性胶质瘤进行基因治疗的有效靶点。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 shRNA 沉默c-Myc 基因对胶质瘤细胞增殖及VEGF 表达的影响研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 个人简历