论文摘要
一、研究背景谷氨酸（glutamate Glu）是一种兴奋性神经递质,病理情况下过量释放,产生的兴奋性和氧化性神经毒性与许多神经退行性疾病都密切相关。绞股蓝[Gynostemma Pentaphyllum（Thunb）Makino]系葫芦科绞股蓝属多年生草质藤本植物,其主要有效成分为绞股蓝皂苷（Gypenosides,GP）。近年来体外实验已经证实GP对Glu氧化性神经损伤具有显著的保护作用,但GP口服进入体内后是否仍然具有保护作用,尚无文献报道。根据血清药理学原理,通过给大鼠口服GP后,提取其含药血清在体外做细胞实验,能够比较好地反映GP在体内转化后的作用。目前关于GP含药血清的研究在国内外尚未见报道。二、研究目的在本课题组以往关于GP对谷氨酸氧化性神经损伤保护作用的体外实验研究基础上,进一步研究GP含药血清对Glu氧化性神经损伤的保护作用,并对其保护机制进行探讨,为研究GP在动物体内对Glu氧化性神经损伤保护作用提供实验依据。三、实验方法采用中药血清药理学方法,收集大鼠GP含药血清,以原代培养的Wistar孕（14～15d）大鼠胚胎大脑皮层神经元为实验材料,原代静置培养24h后,进行分组实验。1、GP含药血清制备:给大鼠分别灌胃不同浓度的GP（对照组灌胃蒸馏水）4天,于末次灌胃1h后,心脏取血,离心分离出含药血清。2、免疫细胞化学法（MAP2抗体标记）鉴定原代培养的神经元纯度。3、实验分组:实验分三组①正常对照组、②Glu损伤组、③GP含药血清保护组。细胞接种培养24h时加入血清:①②组加入对照组大鼠血清,③组加入GP灌胃组大鼠含药血清,终浓度均为5%。继续培养12h后,②③组加入Glu（2mM）,培养12h后进行各指标检测。4、倒置相差显微镜下观察细胞形态,采集各组细胞的形态照片;5、吖啶橙荧光染色观察各组细胞形态学变化。6、MTT法检测各实验组细胞存活力,以确定GP含药血清最佳保护浓度。7、Ho33342和PI荧光双染方法检测各组细胞坏死和凋亡情况。8、分光光度法检测各组细胞内还原性谷胱甘肽（glutathione GSH）含量和总超氧化物岐化酶（superoxide dismutase SOD）活力的变化。9、流式细胞术检测各实验组细胞内游离Ca2+的浓度（Fluo-3/AM对细胞进行染色）和线粒体膜电位（Rh123对细胞进行染色）。10、采用Western blot法检测各组细胞内活性caspase 3表达量的变化。四、实验结果:1、MAP2免疫细胞化学染色观察显示原代培养的神经细胞纯度达90%以上。2、倒置相差显微镜观察:原代培养48h的正常组神经细胞,胞体饱满立体感强呈梭形或三角形,多数神经细胞伸出较长突起,相互之间建立突起联系。谷氨酸损伤12h,较多细胞突起消失,胞体缩成圆形,立体感差,可见较多细胞碎片和凋亡小体。含药血清保护组(400 mg·kg-1·d-1GP灌胃)细胞生长状态良好,细胞间依旧保持良好的突起联系,少见细胞皱缩破碎现象。3、吖啶橙荧光染色显示:正常组细胞核呈圆形或椭圆形,显示黄绿色荧光,细胞质呈橘红色荧光。Glu损伤组较多细胞核出现染色质固缩、边集和核碎裂,部分细胞周围有黄绿色或橘红色荧光的凋亡小体出现。而含药血清保护组(400 mg·kg-1·d-1GP灌胃)少见凋亡和坏死细胞。4、MTT法检测细胞存活率:GP含药血清可明显抑制Glu介导的氧化性神经毒性,与Glu损伤组（34.67%）相比,GP含药血清可维持较高水平细胞存活率（高达89.83%）,400 mg·kg-1·d-1GP灌胃含药血清的保护作用最佳。5、Ho33342和PI双染结果显示:正常对照组细胞核圆形或椭圆形,呈现蓝色荧光;Glu损伤组部分呈蓝色荧光的细胞核固缩、新月形边集或分割成多个圆形小体,荧光强度增强;并有较多呈红色荧光的坏死细胞核:含药血清保护组(400 mg·kg-1·d-1GP灌胃)绝大部分细胞核形态规则呈蓝色荧光,少见红色荧光细胞核。6、分光光度法检测:（1）GSH含量:正常组1443.21mg/L、Glu损伤组523.458 mg/L、含药血清保护组为1063.932 mg/L;与Glu损伤组相比,含药血清保护组(400mg·kg-1·d-1Gp灌胃)细胞内的GSH含量较高,略低于正常。（2）SOD活性:正常组468.66 U/mg,Glu损伤组157.76U/mg,含药血清保护组279.99 U/mg。与Glu损伤组相比,含药血清保护组(400mg·kg-1·d-1Gp灌胃)可以维持细胞内的SOD活性于较高水平。7、流式细胞仪检测:（1）细胞内游离Ca2+浓度:正常组荧光强度值119.86,Glu损伤组269.63,含药血清保护组为170.19;含药血清保护组(400 mg·kg-1·d-1Gp灌胃)的荧光强度值明显低于Glu损伤组,提示含药血清可明显抑制Glu损伤引起的细胞内Ca2+浓度的升高。（2）线粒体膜电位:正常组荧光强度值576.81,Glu损伤组287.52,含药血清保护组447.75;含药血清保护组(400 mg·kg-1·d-1Gp灌胃)的荧光强度值明显高于Glu损伤组,提示含药血清可明显抑制Glu损伤引起的线粒体膜电位降低,抑制Glu对线粒体膜的损伤。8、Western blot法检测:与正常对照组（100）相比,Glu损伤组（255.22）细胞中活性caspase3表达量显著升高,含药血清保护组（163.4）(400mg·kg-1·d-1GP灌胃)的活性caspase3表达量则比Glu损伤组低。提示GP含药血清能够降低Glu引起的活性caspase3表达量的变化;五、实验结论:1、建立了研究绞股蓝皂苷含药血清对谷氨酸氧化性神经细胞损伤保护作用体外实验模型。2、确定了GP含药血清对Glu诱导的氧化性神经损伤有明显的保护作用,以400 mg·kg-1·d-1GP灌胃含药血清（终浓度5%）保护效果最显著。3、Glu的氧化性神经毒性以细胞内GSH的耗竭为主要特征,GP含药血清可以维持细胞内GSH含量和SOD酶活性于较高水平来抑制Glu的氧化性神经毒性。4、GP含药血清可以降低细胞内游离Ca2+浓度、抑制线粒体膜电位降低和损伤、降低细胞内活性caspase 3的含量、阻止“caspase级联反应凋亡事件”的发生等凋亡信号传递途径对Glu的氧化性神经损伤起到保护作用。5、分析确定了GP经体内转化后对Glu氧化性神经损伤仍有保护作用,为研究GP在动物体内对Glu氧化性神经损伤保护作用提供了实验依据。
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