鸭瘟强毒TK基因的原核表达及在感染鸭组织亚细胞定位研究

论文摘要

根据本实验室发现的鸭瘟病毒（DPV）TK基因（GenBank登录号DQ640611）设计并合成了特异性引物,对DPV TK基因进行PCR扩增、序列测定及生物信息学分析,并开展了TK基因原核表达及其免疫原性检测,间接免疫过氧化物酶组织化学染色法（IISM）和间接免疫荧光法（IFA）检测DPV TK基因表达产物方法的建立及其在人工感染鸭体内表达定位的系列研究,获如下结果:1.DPV TK基因分子特性该基因含1077bp,编码358aa。TK蛋白含有两个功能结构域:ATP结合结构域（-DGX XGXG K-）和核苷酸结合结构域（-DRH-）。系统进化树表明DPV TK基因与MDV、ILTV、HVT等禽类疱疹病毒的进化关系最近,与其他疱疹病毒关系则较远。2.DPV TK基因原核表达及其多克隆抗体制备对扩增的TK基因进行pMD18-T载体克隆,通过对pMD18-T-TK及pET-32a（+）进行BamHⅠ、HindⅢ双酶切、连接,将TK基因定向插入pET-32a（+）,经BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定表明,成功构建重组表达质粒pET-32a-TK,并转化入表达宿主菌BL21（DE3）,用IPTG进行诱导表达,表达产物以融合表达的包涵体形式存在,大小为58Ku左右。对表达条件进行优化,确定最佳表达条件为IPTG0.6mmol/L,诱导4h。利用重组表达蛋白所带的6×His标签用镍柱亲和层析方法对其进行纯化,获得较高纯度的重组蛋白。过柱纯化蛋白对家兔进行免疫,制备兔高免血清,Western-Blotting检测显示,与重组表达蛋白特异性结合;ELISA效价高达1:512000。3.间接免疫组化和间接免疫荧光法检测DPV TK基因表达产物方法的建立及其在人工感染鸭体内表达定位对制备兔抗DPV TK高免血清,采用High-Q阴离子柱层析纯化得到兔抗DPVTK IgG,建立间接免疫过氧化物酶组织化学染色法（IISM）和间接免疫荧光法（IFA）检测石蜡切片中DPV的方法;利用建立的IISM和IFA对28日龄鸭人工感染DPV死亡鸭不同组织器官以进行检测。IISM和IFA检测28日龄人工感染DPV死亡鸭的不同组织器官石蜡切片,脑、心、肝、脾、肺、肾、胰脏、腺胃、法氏囊、食道、胸腺、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、直肠、哈德氏腺为阳性或强阳性。该法具有直观、特异性强的优点,应用于检测DPV TK在感染鸭组织细胞中的亚细胞定位具有良好效果,也可用于DPV感染的实验室诊断、病原在鸭组织细胞中分布研究。

论文目录

• 本论文的创新性研究工作
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述及选题目的和意义
• 第一章 病毒TK的研究进展
• 1.鸭瘟概况
• 1.1 引言
• 1.2 病原
• 1.3 流行病学
• 1.4 临床症状
• 1.5 DPV的分离与鉴定
• 2.TK基因研究
• 2.1 TK基因的特点
• 2.2 TK基因的表达调控
• 2.3 TK酶生化特性
• 2.4 TK基因及其编码蛋白的功能域
• 2.5 关于TK基因工程疫苗
• 3.免疫组化技术
• 4.选题目的和意义
• 第二部分 试验研究
• 第二章 鸭瘟病毒TK基因分子特性的分析
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2.结果
• 2.1 DNA序列的测定与分析
• 2.2 DPV TK基因及TK生物信息学分析
• 3.讨论
• 3.1 关于生物信息学及新基因的发现
• 3.2 序列的生物信息学分析
• 3.3 TK蛋白结构与功能分析
• 第三章 鸭瘟病毒TK基因克隆、表达及多克隆抗体的制备
• 1.材料
• 1.2 菌株/毒株/载体/疫苗
• 1.3 试验动物
• 1.4 主要工具酶及试剂
• 1.5 主要溶液的配制（按照参考文献进行）
• 1.6 主要仪器设备
• 1.7 其它
• 2.试验方法
• 2.1 DPV基因组DNA提取
• 2.2 PCR扩增鸭瘟病毒CHv株TK基因
• 2.3 TK基因的T-载体克隆与鉴定
• 2.4 TK基因重组表达菌株的构建
• 2.5 重组蛋白的诱导表达及表达条件的优化
• 2.6 重组蛋白的纯化
• 2.7 兔高免血清的制备
• 2.8 ELISA方法检测兔抗DPV TK抗体效价
• 3.结果
• 3.1 鸭瘟病毒TK基因的扩增、克隆与鉴定
• 3.2 重组表达质粒pET-32-TK的构建及鉴定
• 3.3 重组表达菌株的构建
• 3.4 重组质粒的诱导表达及表达条件优化
• 3.5 重组蛋白的纯化
• 3.6 免疫兔血清的Western-blotting检测
• 3.7 兔抗DPV TK血清ELISA效价的检测
• 3.8 兔抗DPV TK IgG的纯化及SDS-PAGE鉴定
• 4.讨论
• 4.1 TK基因的克隆
• 4.2 表达载体的选择
• 4.3 诱导条件的优化
• 4.4 包涵体的形成
• 4.5 抗血清的制备
• 第四章 免疫荧光方法检测DPV强毒TK在人工感染鸭组织定位分布
• 1.材料
• 1.1 毒株/试验动物
• 1.2 主要试剂及配制
• 1.3 主要仪器设备
• 2.方法
• 2.1 动物感染试验
• 2.2 组织包埋及切片
• 2.3 间接免疫荧光法检测石蜡切片中DPV TK基因产物组织定位方法的建立与优化
• 3.结果
• 3.1 免疫荧光法检测石蜡切片中DPV TK基因产物组织定位条件的优化结果
• 3.2 免疫荧光法各因素随机组合优化结果
• 3.3 特异性试验
• 3.4 间接免疫荧光检测石蜡切片中DPV TK在人工感染鸭体内的表达规律
• 3.5 间接免疫荧光检测石蜡切片中DPV TK基因产物在鸭体内的组织定位分布
• 4.讨论
• 4.1 抗原包被与暴露
• 4.2 荧光强度的影响因素
• 4.3 抗体稀释度、孵育温度及时间的优化
• 4.4 免疫荧光方法检测DPV TK基因表达产物组织分布及其功能分析
• 第五章 免疫酶组织化学法检测DPV强毒TK在人工感染鸭组织定位分布
• 1.材料
• 1.1 毒株/试验动物
• 1.2 主要试剂及配制
• 1.3 主要仪器设备
• 2.方法
• 2.1 动物感染试验
• 2.2 组织包埋及切片
• 2.3 免疫酶组织化学法检测石蜡切片中DPV TK基因产物组织定位方法的建立与优化
• 3.结果
• 3.1 免疫酶组织化学法检测石蜡切片中DPV TK基因产物组织定位条件的优化
• 3.2 经过免疫酶组织化学法个因素随机组合优化结果
• 3.3 特异性试验
• 3.4 免疫酶组织化学法检测石蜡切片中DPV TK在人工感染鸭体内的表达规律
• 3.5 免疫酶组织化学法检测石蜡切片中DPV TK基因产物在鸭体内的组织定位分布
• 4.讨论
• 4.1 间接免疫酶组织化学法建立与优化
• 4.2 免疫酶组织化学法检测DPV TK基因表达产物分布规律研究
• 4.3 DPV TK基因表达产物在鸭体内分布规律与病毒特性、TK基因功能的关系
• 第三部分 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 攻读硕士学位期间以第一作者身份发表的论文