论文摘要
目的观察脓毒症大鼠脾脏T淋巴细胞凋亡与免疫麻痹发生的相关性。观察高糖皮质激素血症及T淋巴细胞过度活化两种促凋亡因素对脾脏T淋巴细胞凋亡、凋亡相关基因mRNA表达及caspase3活性的影响，明确脓毒症时脾脏T淋巴细胞的凋亡机制及调节因素。探讨活血化瘀中药调节T淋巴细胞凋亡，改善脓毒症免疫功能的作用及机制。方法第一部分首先以盲肠结扎穿孔（CLP）法制备脓毒症大鼠模型，假手术组及模型组各10只，检测模型的各项生理及生化指标。然后将96只Wistar大鼠随机分为正常对照组（8只）、假手术组（8只）、脓毒症组（40只）和中药组（40只），中药组动物行CLP术后予活血化瘀中药注射。脓毒症组和中药组再分别分为4 h、8 h、24 h、36 h和48 h五个时间点。分别于术后各个时间点以ELISA法检测血清IL-2、IL-10水平，TUNEL法检测脾细胞凋亡情况，流式细胞仪检测脾脏淋巴细胞中CD3+细胞比例，分光光度法测定脾组织caspase3活性以及免疫组化法检测脾组织Fas、FasL、Bcl-2、Bax蛋白表达水平。第二部分提取BAB／C小鼠脾脏T淋巴细胞并培养，分别以地塞米松和活化诱导细胞凋亡（AICD）方法进行凋亡诱导。于地塞米松诱导6 h、16 h及活化诱导18 h后以流式细胞仪检测T淋巴细胞的凋亡率，并于地塞米松诱导6 h及活化诱导6 h、1 8 h后RT-PCR法检测T淋巴细胞内Fas、FasL、Bcl-2、Bax mRNA表达水平，分光光度法测定细胞内caspase3酶活性。同时观察活血化瘀中药对上述各项指标的影响。第三部分提取BAB／C小鼠脾脏T淋巴细胞并培养，观察活血化瘀中药对静息及活化T细胞增殖活性影响的MTT检测，流式细胞仪检测中药干预后静息T淋巴细胞的自然凋亡率。再分别以地塞米松和活化诱导法进行凋亡诱导，并以活血化瘀中药进行干预，RT-PCR法检测T淋巴细胞内IL-2 mRNA表达水平。结果第一部分实验中脓毒症组大鼠于造模后出现脾组织caspase3活性升高、细胞凋亡数增多，而脾细胞中CD3+细胞比例明显下降。并于造模后36 h、48 h，血清IL-2水平明显下降，IL-10水平显著升高，显示出免疫麻痹的表现。同时脓毒症组脾组织Fas、FasI、Bax表达明显增多，Bcl-2表达下降。活血化瘀中药干预后可提高IL-2水平，降低IL-10水平，减轻脾组织caspase3活化程度，减少脾细胞凋亡，并使CD3+细胞比例恢复正常。同时可明显降低脾组织Fas、FasL、Bax表达，促进Bcl-2表达。第二部分实验中地塞米松诱导6 h后T淋巴细胞凋亡率即明显增加，至16 h细胞较少存活。诱导6 h后T淋巴细胞内BaxmRNA表达升高，Bcl-2 mRNA表达下降，Fas mRNA表达无变化，无FasL mRNA表达。以活化诱导凋亡的T淋巴细胞于诱导18 h后细胞凋亡率明显增加，于诱导6 h时未见FasL、Bax mRNA表达，Fas、Bcl-2 mRNA表达无明显变化；于诱导1 8 h后Fas、FasL、Bax mRNA表达升高，Bcl-2mRNA表达下降，caspase3活性增高。活血化瘀中药可降低两种促凋亡因素诱导的T细胞凋亡，并可分别降低Fas、FasL、Bax mRNA表达，提高Bcl-2 mRNA表达，减轻caspase3酶活性。第三部分实验中活血化瘀中药可以促进静息及活化脾脏T淋巴细胞的增殖活性，降低静息T细胞的自然凋亡率。增加地塞米松诱导6 h后的T淋巴细胞内IL-2 mRNA表达。在活化诱导早期（6 h）促进T淋巴细胞内IL-2 mRNA表达，在晚期（18 h）减少IL-2 mRNA表达。结论脾脏T淋巴细胞的异常凋亡与脓毒症免疫麻痹的发生相关，并受凋亡相关蛋白调节。脓毒症状态下的高糖皮质激素血症及T淋巴细胞过度活化引起的AICD是脾脏T淋巴细胞异常凋亡的诱发因素，地塞米松诱导的凋亡受Bax、Bcl-2 mRNA表达的调节，而AICD的发生与Fas、FasL、Bax、Bcl-2 mRNA表达的改变有关。活血化瘀中药可通过调节IL-2 mRNA表达而减轻两种因素诱导的脾脏T淋巴细胞凋亡，同时可以促进T淋巴细胞的增殖活性，减轻T细胞的自然凋亡率，缓解脓毒症时的免疫麻痹。
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