论文摘要
背景及目的BCG作为预防TB的唯一疫苗在全球广泛使用。发展中国家每年有超过90%的儿童接种BCG疫苗。但BCG对成人TB的保护效力却存在很大波动,其机制尚不明确。目前,M.tb H37Rv基因组中共鉴定了16个BCG缺失区域即RD区。其中RD1区仅存在于致病性分枝杆菌中,在世界各地的BCG菌株中均缺失,被认为是BCG最初减毒的主要决定因素;RD2区缺失,可以进一步把世界范围内分布的不同BCG亚株分为早期株和晚期株。目前已经明确RD1区丢失的同时对BCG的保护效果也产生了影响。那么,RD2区的缺失会给BCG的保护效力带来什么样的影响呢?是否会是造成BCG对成人TB保护性不稳定的原因呢?针对这些问题,我们分别建立了RD1区所编码的融合抗原ESAT-6-CFP10（rEC）和RD2区所编码的融合抗原CFP21-MPT64（rCM）的原核表达系统和真核表达质粒（我们的前期工作已研究rCM原核表达系统的构建和免疫原性）。首先比较了两种融合抗原在人群中的免疫原性;其次,在C57BL/6小鼠模型中比较研究这两种重组真核质粒作为DNA疫苗,在BCG初免联合DNA疫苗增强策略中的免疫保护性;最后,进一步探讨RD2区缺失对BCG保护效力带来的影响和初免增强策略的优越性。方法1.利用PCR法分别扩增获得esat-6和cfp10的基因;用GeneSOEing技术构建新的融合基因esat-6-cfp10,并将其分别克隆入原核表达载体pProEXHTb和真核表达载体pcDNA3.1（-）中,得到重组原核表达质粒pPro610和重组真核质粒pcD610。将表达融合蛋白rCM的重组原核质粒pPro2164酶切,亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1（-）中,得到重组真核质粒pcD2164。2.分别将pPro610和pPro2164转化入E.coli BL21菌株,经IPTG诱导表达,Ni-NTA纯化,尿素梯度透析复性获取rEC和rCM蛋白。rEC蛋白的表达和纯化的过程,分别用SDS-PAGE验证,并用anti-ESAT-6和anti-CFP10 Ab经Western blotting验证。纯化rEC和rCM蛋白的纯度进一步用SDS-PAGE证实,并经BCA法定量。3.分别将pcD610和pcD2164转化的E.coli DH5α扩增,用Qiagen Plasmid Giga kit提取纯化,并经紫外吸收法定量。4.对活动性肺结核的密切接触者进行WBIA（the whole blood IFN-γassay）试验,比较两种融合抗原rEC和rCM在人群中的免疫原性。5.采取BCG（中国株）初免-pcD610或pcD2164增强的方式,免疫C57BL/6小鼠,通过ELISA法检测外周血特异性抗体和体外抗原诱导脾淋巴细胞产生的IFN-γ、qRT-PCR法检测肺脏组织细胞因子和iNOS mRNA表达水平等手段,分析比较不同免疫策略中疫苗在小鼠模型中的免疫原性。6.对免疫后的小鼠进行M.tb H37Rv毒株攻击实验,通过组织荷菌量、组织病理学改变等指标评价不同免疫策略中疫苗的保护性。结果1.基因测序和酶切证实重组原核质粒及重组真核质粒构建成功。2. SDS-PAGE和Western blotting试验证实融合抗原rEC的原核表达和纯化成功;纯化的rEC和rCM经SDS-PAGE证实。3. rEC-WBIA刺激TST+健康人群产生了比TST-健康人群更高的IFN-γ（p< 0.05 ）;rCM-WBIA刺激TST+健康人群产生了比TST-健康人群更高的IFN-（γp<0.05）; rCM-WBIA中TST+健康人群和TST-健康人群产生的IFN-γ水平,均高于rEC-WBIA中的结果,但差异均不具有统计学意义（p>0.05）。4.小鼠外周血抗原特异性IgG抗体分析结果表明针对融合蛋白rEC的特异性抗体反应,pcD610免疫组和BCG初免pcD610增强免疫组明显高于其它组;针对融合蛋白rCM的特异性抗体反应,pcD2164免疫组和BCG初免联合pcD2164增强免疫组最高。5.抗原特异的小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ检测结果为:重组质粒免疫组和BCG与重组质粒联合免疫组的IFN-γ水平明显高于BCG组,且BCG初免联合pcD2164增强免疫组最高。6.免疫小鼠肺脏组织中,与免疫保护有关的细胞因子IFN-γ、TNF-α和可抑制细菌生长的iNOS mRNA表达,BCG初免DNA增强免疫组都表现出强于或与BCG组相当的水平;相对地,在抑制保护性免疫、利于细菌生长的调节性细胞因子TGF-β和IL-10 mRNA表达中,BCG初免DNA增强免疫组则处于较低的水平。7. M.tb H37Rv攻击4周后,小鼠组织荷菌量数据表明,疫苗免疫组都有不同程度的下降,其中BCG初免联合DNA增强免疫组比仅接种BCG或DNA疫苗组更低,最低荷菌量出现在BCG初免联合pcD2164增强免疫组中。8.肺脏组织病理学检查结果与荷菌量一致,采用BCG初免联合DNA增强免疫方案组的病理改变评分明显低于仅接种BCG或DNA疫苗组,且BCG初免联合pcD2164增强免疫组最低。结论我们的研究表明pcD610和pcD2164是两种在初免-增强策略中有着良好应用前景的候选DNA疫苗,且支持RD2区缺失会对BCG保护效力产生重要影响的观点。这一发现不但有助于筛选保护性最优的BCG株用于新生儿接种,而且有助于构建合理有效的抗TB新疫苗。
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